Биотехнология получения метаболитов, с использованием генномодифицированных микроорганизмов. Биотехнология инсулин


Биотехнология получения инсулина, гормона роста и интерферона

Получение инсулина.

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочного предшественника – проинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжёлая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удаётся справляться с помощью соответствующих диет и режима.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 г исходного сырья.

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг тремя коллективами исследователей в США, Китае и Германии. В 1980 г датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путём замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и длительности действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 30 лет назад. В 1978 году появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli (рис. 8.21):

1.Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3'-концу гена фермента в-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду - pBR322 (1).

2. Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента в-галактозидазы и А и В пептида инсулина, присоединённого к ней через остаток метионина (2).

3. После обработки химерного белка бромцианом и протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

 

 

Рис. 8.21. Схема синтеза инсулина

Синтез соматотропина (гормона роста или ГР).

Соматотропин секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен (и очищен) в 1963 г из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза забитых на мясокомбинате животных, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости и лишь в развитых странах. Основные производители – Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГР человека состоит из 191 аминокислотного остатка.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГР синтезируют методами гинетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках E. Coli, ГР содержит дополнительный остаток метионина на h3N-конце молекулы. Биосинтез гормона роста из 191 аминокислотного остатка был впервые осуществлён в 1979 году Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путём расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей, со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 1000 000 молекул гормона на клетку.

Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г после многолетних клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

ГР в клетках E. Coli и в культуре клеток животных был получен в 1984 году одновременно в институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГР, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Огромный интерес представляют выделение и промышленный синтез полипептида, аналога гипоталамического релизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, таких, как карликовость (для увеличения живой массы и ускорения роста человека и животных), всех форм диабета, регенерации тканей после ожогов и др. Это происходит за счёт того что он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у человека и животных.

В селекции крупного рогатого скота перенос гена соматотропина позволяет, по оценке учёных: 1. Увеличить молочную продуктивность и живую массу животных; 2. Повысить содержание белка в молоке и мясе. Научный интерес к действию соматотропина на лактацию млекопитающих проявился ещё более 70 лет назад. Первые работы поизучению влияния соматотропина на молочную продуктивность коров были осуществлены в России ещё в 1937 г (Азимов Г., 1937). В этих исследованиях впервые было показано, что введение неочищенного экстракта из гипофиза приводит к повышению молочной продуктивности лактирующих коров на 8%. Однако сложность очистки этого гормона и весьма ограниченные возможности его производства не позволяли провести широкие исследования по изучению механизмов его действия на молочную продуктивность. И только позднее в экспериментах с использованием соматотропина крупного рогатого скота тонкой очистки было установлено, что ежедневное введение экзогенного гормона приводило к повышению надоев молока на 10-40%. Однако в этих опытах увеличение надоев молока отмечалось лишь в первые 14-16 дней (Banman D., Mc-Cutehon S., 1985).

Известно, что гормон роста, действуя на поверхностные рецепторы клетки, повышает в них синтез белка. Опыты по использованию соматотропина на молочных коровах показали, что, имеется тесная связь между действием гена этого гормона и продуктивностью. Фирма «Монсанто», которая разработала генно-инженерный способ синтеза гормона роста крупного рогатого скота доказала его эффективность (2002 г). При этом отмечается, что самый большой вклад в увеличение продуктивности может дать использование именно этого гормона. Предполагается, что в США к 2018 году этот гормон будут получать 50% коров. Наряду с усовершенствованными технологиями применение гормона позволит повысить средний удой молока от коровы к 2020 году до 9281кг и сократить число коров на 20%.

Получение интерферона.

Интерферон был открыт в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне, как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутых воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Он препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и, в силу этой способности, был назван интерфероном.

Известны три группы интерферонов:

1. α (альфа-интерфероны, α-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты;

2. β (бета-интерфероны, β-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибробласты;

3. λ (гамма-интерфероны, λ-И), продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжёлых заболеваний – острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы, ряда опухолей гортани, лёгких и мозга.

С учётом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека и животных. Традиционно их извлекают из крови человека и животных (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. одну дозу для инъекции). До последнего времени бόльшая часть мирового производства интерферонов осуществлялась в Финляндии и Франции. С 1990 года одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом Сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лабробласты выращивали в ферментёрах объёмом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден β-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что даёт возможность массового производства. Метод получения β-интерферона был разработан в Англии.

Выше перечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. ДНК, полученные обратным траскрибированием, были клонированы в E. Coli (рис. 8.23). Это явилось революционным событием в теоретических и прикладных исследованиях интерферонов. Метод состоит из следующих элементов:

1. Ген интерферона от человека встраивают в векторную ДНК; 2. Присоединяют к нему бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке.

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий:

Рис. 8.23. Схема рекомбинантной плазмиды,

Похожие статьи:

poznayka.org

Биотехнология получения метаболитов, с использованием генномодифицированных микроорганизмов

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Методы генной инженерии преобразуют клетки микроорганизмов в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Получение инсулина на основе методов генетической инженерии. Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечнососудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника – препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид).

Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800 – 1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 – 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

В 1978 году исследователи из компании «Генентек» впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Клетки Е. coli, трансформированные рекомбинантными плазмидами (pBR322), содежащими синтетические гены инсулина, производили гибридные белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождался.

В 1980 г. была выделена мРНК инсулина из опухолевых клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встроили в плазмиду pBR322 E. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выделяли из такого белка трипсином. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Получение соматотропина на основе методов генетической инженерии. Соматотропин – гормон роста человека (ГРЧ), секретируемый гипофизом. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Гормон обладает видовой специфичностью. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 – 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Препарат из трупного материала представляет собой смесь белков, из которых пять имеют 22 кДа, другие являются димерами, а остальные – фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность.

В настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Ген гормона роста человека длиной 584 п.н. сначала клонируют; далее путем расщепления получают последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, затем получают синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. После этого два фрагмента объединяют в единую структуру с помощью ДНК-лигазы и встраевают в плазмиду, реплицирующуюся в Е. coli под контролем промотора триптофанового оперона.

Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуцируют при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека.

Получение интерферонов на основе методов генетической инженерии. Интерферон – ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видовой специфичностью. Клетки животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать клеткам устойчивость к вирусной инфекции, препятствуя (интерферируя) размножению вирусов в клетке.

Известны три группы интерферонов: α-интерфероны (α-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты; β-интерфероны (β-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибробласты; γ-интерфероны, продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Традиционно интерфероны извлекают из крови человека (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. примерно одну дозу для инъекции). Получение β-интерферонов осуществляется с использованием лимфобластоидных клеток. С этой целью клетки фибробластов, получаемые из тканей плода и поддерживаемые в культуре клеток индуцируют вирусом сендай, после чего интерферон выделяют с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В целом вышеперечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата.

На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов (рис. 8.13).

Рис. 8.13. Схема рекомбинантной плазмиды кДНК, полученные обратным транскрибированием, клонируют в Е. coli (ген интерферона встраивают в векторную ДНК, и к нему присоединяют бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке).

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Данная процедура осуществлется следующим образом. Ген интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau 3А1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Триплет ATG, кодирующий цистеин, отщепляют ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически синтезируют небольшой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG – точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединяют к изолированной части зрелого гена, и в результате получают полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген вводят в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК.

Синтезированный генно-инженерным способом интерферон имеет близкие физико-химические свойства интерферону, полученного из крови доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 л крови доноров.

При использовании генно-инженерных технологий в разных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирующих различные интерфероны: α-, β- и γ-типов. Недостаток использования Е. coli для получения β- и γ-интерферонов – отсутствие в бактерии аппарата гликозилирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликозилированных молекул. И хотя роль гликозилирования неясна и негликозилированные β- и γ-интерфероны практически полностью сохраняют противовирусную активность, эта особенность диктует осторожный подход к использованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликозилирование.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ:

1. Аминокислоты и их использование в пищевой промышленности и медицине

2. Химический и микробиологический синтез аминокислот.

3. Использование ауксотрофных мутантов для биосинтеза L-лизина.

4. Биотехнологическое получение лизина.

5. Биотехнологическое получение триптофана.

6. Ферментативный способ получения аминокислот.

7. Микробиологический синтез лимонной кислоты.

8. Микробиологический синтез витаминов группы В, витаминов А и Д.

9. Принципы классификации антибиотиков.

10. Стадии производства антибиотиков. Условия проведения ферментации, особенности выделения готового продукта

11. Микробиологическое производство пенициллина. Фермент пенициллаза. Синтез аналогов пенициллина.

12. Ферментативный способ получения 6-аминопенициллановой кислоты и её ацилированние.

13. Производство инсулина. Биосинтез и физиологическое действие.

14. Выделение инсулина из поджелудочной железы домашних животных.

15. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК, содержащей ген человеческого инсулина.

16. Производство интерферонов. Производство лейкоцитарного интерферона из донорской крови.

17. Ген интерферона и синтез копии ДНК интерферона на мРНК. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК с геном интерферона. Биотехнология производства интерферона, особенности его выделения и очистки.

18. Производство соматотропина. Выделение соматотропина из трупного материала.

19. Биотехнологический способ производства соматотропина.

Похожие статьи:

poznayka.org

Биосинтез инсулина человека в клетках кишечной палочки

Инсулин - это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата.

Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков.

При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание - диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние - диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэнгером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был разработан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В на остаток треонина.

Это удалось достигнуть путем ферментативного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (человеческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина исходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 аминокислот - препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для прохождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщепляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с помощью ферментов.

Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной железы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), которая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пенициллиназы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили рекомбинантную плазмиду. Как показало определение последовательности ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина, но не препроинсулина.

При трансляции и-РНК в клетках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом молекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из поджелудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазмиду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи соединяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина синтезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК-полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к минимуму. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона -200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 месяцев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ).

Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммунологических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках имеет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелудочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сырья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чистоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая затратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

medbe.ru

Учебное пособие для студентов лечебного факультета и слушателей факультета последипломного образования

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра патофизиологии лечебного факультета

Филатов О.Ю., Малышев И.Ю. клеточные биотехнологии в ЭНДОКРИНОЛОГИИ

Учебное пособие для студентов лечебного факультета и слушателей факультета последипломного образования

Москва 2010

СОДЕРЖАНИЕ стр.

АННОТАЦИЯ 3
Часть 1. Биотехнология получения гормонов 5
Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК 5
Глава 2. Рекомбинантный фоллитропин 31
Глава 3. Рекомбинантный гормон роста 37
Часть 2 Биотехнология использования клеток в терапии 39
Глава 1. Диабет и клеточная трансплантация 39
Глава 2. Диабет и стволовые клетки 47
Глава 3. Трансфекция (перенос) гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной их трансплантацией 56
Часть 3. Перспективы биотехнологии. Топологическая концепция создания биоискусственных органов на примере щитовидной железы

59

Список литературы 65
РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ 66
КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ 75

Аннотация: Учебное пособие посвящено использованию современных методов клеточных биотехнологий в эндокринологии, и предназначено для методического обеспечения инновационно-образовательной деятельности медицинского ВУЗа. Учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных сотрудников медицинских ВУЗов. В представлен вклад биотехнологии в развитие эндокринологии и, прежде всего, создание генно-инженерных лекарственных препаратов: гормонов (инсулин, гормон роста), рекомбинантных гонадотропинов. К последним можно отнести рекомбинантный фоллитропин, применяющийся для гиперстимуляции яичниов при лечении бесплодия, и другие гормоны половой сферы. Современные достижения генной инженерии позволили создать ряд аналогов инсулина, обладающих заданными свойствами абсорбции из подкожного депо, что облегчило контроль уровня инсулина в крови. В пособии описаны и перспективные направления биотехнологии в области эндокринологии, например, замещение инсулин-продуцирующих клеток при сахарном диабете типа 1 за счет стволовых клеток. Источником таких клеток, способных дифференцироваться в инсулин-продуцирующие, может служить как эмбриональная ткань, так и ткани и органы взрослого организма (в особенности поджелудочная железа и жировая ткань). Вопросы дифференцировки стволовых клеток, развития инсулин-продуцирующих клеток из стволовых, выбора наиболее оптимального источника стволовых клеток для тканевой инженерии подробно освещены в пособии. Другим подходом, разрабатываемым в настоящее время является микроинкапсуляция пересаженных от донора островков Лангерганса с целью избегания иммунного отторжения. В пособии также рассматрены подходы к созданию биоинженерного аналога щитовидной железы ex situ с акцентом на топологический подход.

  • область применения (факультет, учебный курс): Лечебный факультет и ФПДО; курсы «Патофизиология» и «Клеточные биотехнологии в современной медицине»
  • характер издания (учебник, учебное пособие и др.): рукопись учебного пособия
  • формируемые компетенции (знания, умения и навыки): Теоретические и практические основы использования клеточных биотехнологий в эндокринологии
  • объем (печатных листов или др.): 80 стр. формата А4.

Часть 1. Биотехнология получения гормонов.

Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК.

Если мы спросим, каков наиболее перспективный источник инсулина, спасающего жизни больных диабетом на протяжении последних десятилетий, то ответ будет очевиден – это рекомбинантный, или биосинтетический инсулин, т.е. инсулин, полученный из клеток бактерий или дрожжей путем применения технологии рекомбинантной ДНК. До разработки этой технологии использовался инсулин, получаемый из поджелудочной железы животных – свиней и коров, однако структура его несколько отличалась от структуры человеческого инсулина, что служило причиной осложнений со стороны иммунной системы, не желающей принять чужеродный белок. Впрочем, практически одновременно с разработкой технологии биосинтетического инсулина, появилась технология получения т.н. полусинтетического инсулина, полностью аналогичного человеческому, путем определенных модификаций инсулина свиней. Этот метод основан на использовании свиного инсулина с ферментно-химической заменой аланина в 30 позиции В-цепи на треонин. Основным недостатком данного метода является зависимость от получения необходимого количества инсулина от свиней, что в будущем при возрастающих потребностях в инсулине грозит серьезными сырьевыми трудностями.

Таким образом, технология рекомбинантной ДНК на сегодняшней день является ведущей технологией по получению инсулина: она позволяет синтезировать сколь угодно большие объемы белка и открывает широкие возможности по созданию аналогов инсулина с заданными свойствами.

Первый коммерческий выпуск человеческого инсулина с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в 1980 г. стал результатом совместной деятельности клиники «Город Надежды» (Дуарте, Калифорния), университета Калифорнии (Сан-Франциско), корпорации Genetesch и Eli Lilly. Синтезировались гены А- и В-цепей инсулина, после чего вводились в ген -галактозидазы и экспрессировались в Echerichia coli. При получении продукта А- и В-цепи инсулина отделяли от бактериальных белков с помощью цианобромида. Из А- и В-цепей после очистки в дальнейшем синтезировался человеческий инсулин.

В 1986 году тактика производства рекомбинантного инсулина несколько изменилась: инсулин стали получать путем процесса ферментивного преобразования биосинтетического человеческого проинсулина. Ген, кодирующий человеческий проинсулин внедряется в специальные непатогенные штаммы К12 кишечной палочки, которые затем выращивают в процессе ферментации для получения человеческого инсулина. Этап ферментации останавливают путем термической стерилизации, чтобы устранить любую возможность контаминации бактериальными организмами. Таким образом, при биосинтетическом производстве инсулина геном инсулина человека встраивают в геном микроорганизмов – бактерий или дрожжей, которые начинают синтезировать предшественники инсулина, из которых потом ферментативным способом получают инсулин.

Современные технологии двух крупнейших производителей человеческого инсулина - Eli Lilly и Novo Nordisk - отличаются по патентно-правовым причинам. Eli Lilly – первый производитель человеческого инсулина, использовавший генно-инженерную технологию, работает на геноме человека, с помощью которого кишечные палочки синтезируют проинсулин, превращающийся в инсулин после ферментативного отщепления С-пептида. Novo Nordisk применяет синтетически полученную ДНК для «мини-проинсулина» (проинсулина, в котором С-пептид короче, чем в проинсулине человека), которая затем вводится в геном клетки пекарских дрожжей. В дальнейшем из мини-проинсулина ферментативным способом выделяют инсулин.

Структура биосинтетического человеческого инсулина полностью аналогична таковой «натуральной» молекулы, что позволяет снизить количество осложнений, связанных с образованием антител. Основной сложностью, возникающей при синтезе рекомбинантного инсулина, является загрязнение продукта собственными белками бактерий, а также наличие иных примесей (например, примеси проинсулина). Эта проблема была полностью решена введением сложного процесса очистки получаемого белка путем многоступенчатой гельфильтрационной и ионообменной хроматографии, в результате которых в современном биосинтетическом инсулине примеси не определяются даже высокочувствительными методами.

Синтез инсулина бактериальными клетками.

Итак, в чем суть технологии биосинтеза инсулина [1] при использовании бактериальных клеток? «Фабрикой» по производству инсулина является всем известная кишечная палочка, обитатель пищеварительного тракта человека. Бактерия E.coli является, пожалуй, наиболее изученной бактериальной клеткой, а также клеткой-мишенью наиболее изученных бактериофагов. Сама по себе кишечная палочка не способна поглощать экзогенную ДНК, поэтому необходимо создать условия для проникновения чужеродной ДНК внутрь клетки, а также ее последующей репликации. Клетка E.coli окружена муреиновым мешком, прилегающим к внешней мембране: путем обработки клеток лизоцимом получают сферопласты. Для этого сначала применяют комплексообразователь этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), связывающую двухвалентные катионы, которые стабилизируют липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий. После этого лизоцим уже может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его, что значительно повышает проницаемость бактериальной клетки и позволяет ввести в нее векторную ДНК.

Однако прежде чем вводить необходимый ген в клетку, его необходимо получить и ввести в состав вектора. Для этого существуют различные подходы: например, выделение искомого гена из нативной молекулы ДНК или синтез копии гена по матрице выделенной мРНК, однако, поскольку нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей проинсулин, а также А- и В-цепи инсулина известна, наиболее удобным является метод химического синтеза ДНК. Для синтеза А-цепи инсулина необходимо 63 нуклеотида и 90 нуклеотидов для В-цепи, плюс кодон на конце каждой цепи, сигнализирующий об окончании синтеза белка (стоп-кодон). Кроме того, к началу каждого фрагмента ДНК, кодирующего А- или В-цепь, добавляют анти-кодон, кодирующий метионин, чтобы в последующем можно было отделить молекулу инсулина от фрагмента бактериального белка. Далее синтезированные гены А- и В-цепей инсулина (либо ген проинсулина) вставляют в ген бактериального фермента - -галактозидазы (lacZ), и затем всю эту конструкцию помещают в векторную плазмиду [1]. Что представляет собой вектор? Это носитель, задачей которого является доставить нужную ДНК в клетку-носитель и обеспечить ее экспрессию. Часто в качестве вектора используют плазмиды – кольцевидные самореплицирующиеся нехромосомные формы организации ДНК, присутствующая в большинстве бактерий (см. рис.1). Помимо гена, кодирующего нужный белок (например, ту или иную цепь инсулина, либо проинсулин), вектор должен нести в своем составе регуляторные элементы, необходимые для экспрессии данного гена (в нашем случае транскрипцию гена инсулина будет обеспечивать промотор гена -галактозидазы, упомянутой выше), а также маркерный ген, позволяющий отличить трансформированные клетки от нетрансформированных (часто это ген устойчивости к какому-либо антибиотику, например, ампициллину). dna13Рис.1. Электронная фотография бактериальной плазмиды. Каким образом можно вставить нужный ген в плазмиду? В этом помогают специальные ферменты, «разрезающие» молекулу ДНК в участках, соответствующих определенным последовательностям нуклеотидов длиной 4-8 нуклеотидных пар (это т.н. сайты рестрикции). Ферменты эти были открыты в 1968 году и названы рестриктазами. В природе рестриктазы являются элементом бактериальной защиты от фагов: в каждом сайте рестрикции собственной ДНК бактерии остатки аденина и цитозина подвергаются метилированию, что препятствует работе рестриктазы, в то время как, если в клетку попадает чужеродная ДНК (например, бактериофага), рестриктаза режет ее на кусочки. В генной инженерии рестриктазы используются в качестве «молекулярных ножниц», разрезающих плазмиду (в том месте, куда необходимо вставить ген), а также для выделения нужного гена из более протяженного участка ДНК. После разрезания рестриктазой на концах получившихся фрагментов ДНК образуются т.н. «липкие» концы, которые при смешивании плазмид и генов формируют временные связи, а затем ген окончательно «пришивается» к плазмиде ферментом ДНК-лигазой (см. рис.2).

dna15

Рис.2. Пример «работы» рестриктазы. В данном случае сайтом рестрикции является последовательность aaactc и tttgag.

Итак, все необходимые гены находятся в составе плазмиды и плазмида введена в бактерию. Что происходит дальше? Необходимо произвести селекцию, т.е. отобрать те бактерии, в которых находится и экспрессируется ген инсулина. Для этого бактерии выращивают последовательно в двух средах: одна из них содержит ампициллин, другая – вещество, реагирующее с продуктом гена lacZ. При выращивании в ампициллин-содержащей среде, бактерии, не получившие векторные плазмиды вместе с геном устойчивости к ампициллину гибнут, те же кишечные палочки, которые захватили плазмиды, остаются в живых и размножаются. Помимо этого, необходимо выделить те бактерии, внутри которых находятся именно рекомбинантные плазмиды (ведь плазмида при инкубации с геном может и не включить его в свой состав). Мы должны вспомнить, что ген инсулина вставляли внутрь гена lacZ, кодирующего фермент -галактозидазу. Бактерии с интактным lacZ геном окрашиваются в специальной среде в синий цвет. Очевидно, что в бактериях, несущих рекомбинантные плазмиды, -галактозидаза не экспрессируется, и такие бактерии в синий цвет окрашиваться не будут. В дальнейшем, когда не окрашенные и выжившие в ампициллиновой среде бактерии размножаются, нам остается только удостовериться в том, что они экспрессируют ген проинсулина (или одной из его цепей). Для этого существует ряд способов. Во-первых, можно определить содержание продукта в бактериальной среде. Во-вторых, можно провести кДНК-гибридизацию: синтезировать фрагмент ДНК, комплементарный гену проинсулина (или его участку), присоединив к нему радиоактивный или флуоресцентный зонд. В дальнейшем бактериальную ДНК денатурируют и инкубируют с содержащим зонд фрагментом. Если искомый ген есть в геноме бактерии, он связывается с зондом и «выдает» себя по свечению или радиоактивному излучению.

Таким образом, получают кишечные палочки, содержащие ген, кодирующий одну из цепей инсулина, либо проинсулин. Бактерии размножаются, ген реплицируется и экспрессируется. (рис.3). dna18

Рис.3. Получение бактерий, содержащих ген, кодирующий цепь инсулина

Синтезируемый такими бактериями белок представляет собой фрагмент -галактозидазы, соединенный с А- или В-цепью инсулина (или с проинсулином). Цепочки инсулина отщепляют от -галактозидазы и очищают. Затем их смешивают и путем реакции образования дисульфидных связей получают биосинтетический инсулин (Humulin). В случае же получения проинсулина добавляется еще этап ферментативного отщепления С-пептида. Получение инсулина из клеток дрожжей. Лидерные последовательности.

Альтернативой инсулину, получаемому из бактерий, является рекомбинантый инсулин, получаемый из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Эти прокариотические организмы способны синтезировать не отдельные цепи, а цельную молекулу инсулина (или его предшественника), что минимизирует необходимость в сложных и дорогостоящих процедурах очистки продукта. S. сerevisiae обладают сложной многокомпонентной секреторной системой, позволяющей осуществлять посттрансляционные модификации гетерологичных белков, в т.ч. N- и О-гликозилирование, а также формирование дисульфидных связей. Эти модификации аналогичны таковым, происходящим в клетках млекопитающих, что позволяет синтезировать с помощью дрожжей биологически активные белки млекопитающих, в т.ч. инсулин.

Вспомним, как происходит биосинтез инсулина в клетках островков Лангерганса. Сначала синтезируется препроинсулин, имеющий структуру препептид-В-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, где А и В – это А- и В-цепи проинсулина соответственно, а С – это С-пептид. Препептид отщепляется при транспортировке молекулы в эндоплазматический ретикулум (ЭПР). К тому времени, как проинсулин достигает аппарата Гольджи, уже успевают сформироваться дисульфидные связи, придающие ему определенную структуру в пространстве. Затем проинсулин расщепляется в двух точках, так что отщепляется С-пептид и образуется инсулин.

В клетках дрожжей подобная система осуществляет посттрансляционные модификации -фактора. Что такое - -фактор? Это собственный белок дрожжей, принимающий самое непосредственное участие в их половом размножении. Дело в том, что существенным элементом жизненного цикла этих эукариотических организмов является стадия коньюгации. На этой стадии гаплоидные клетки (т.е. клетки несущие по одной копии каждой хромосомы) сливаются, образуя диплоидную клетку. Для того чтобы прошел процесс коньюгации (коньюгация может происходить между клетками разных половых типов; принадлежность к половому типу определяется геном MAT, имеющем два аллельных состояния a и ) необходимо чтобы сливающиеся клетки были остановлены в точке G1-S перехода. Остановка достигается с помощью вышеупомянутого -фактора, выделяемого в среду клетками полового типа . -фактор рецептируется клетками типа а, которые в ответ останавливаются в точке G1-S перехода. Так вот, возвратимся к биосинтезу -фактора в клетках дрожжей: первоначально синтезируется его предшественник - препептид-Lys-Arg-(Glu-Ala)2-F-Lys-Arg-(Glu-Ala)3-F-(Lys-Arg-

Glu-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-F)2. Далее он подвергается процессингу, в ходе которого происходит трипсиноподобное расщепление в точках последовательностей Lys-Arg, а потом дипептидиламинотрансферраза вырезает последовательности Glu-Ala и Asp-Ala [Thim L et al. 1986].

Особенностью биосинтеза инсулина в клетках дрожжей является необходимость добавления к гену, кодирующему инсулин, лидерной последовательности, благодаря которой и становится возможным осуществление посттрансляционных модификаций «объединенного» белка. С этой целью наиболее часто используется препролидерная последовательность вышеупомянутого -фактора (см. рис. 4).

mr0100001008Рис.4. Структура «объединенного» белка, состоящего из препептида, пропептида, сайта распознавания Kex2, пептидного спейсера и предшественника инсулина. Звездочками отмечены точки N-гликозилирования.

Присоединенная к гену гетерологичного белка препролидерная последовательность -фактора опосредует в дальнейшем транслокацию предшественника инсулина в ЭПР, а оттуда – в аппарат Гольджи. При этом в ЭПР происходит отщепление сигнальной пептидазой пре-региона лидерной последовательности, а в аппарате Гольджи эндопротеаза Kex2 отщепляет ее про-регион. Kex2 «работает» на определенном участке, состоящем из двух аминокислот – Lys-Arg. Далее, уже перед самой секрецией, дипептидиламинотрансфераза, кодируемая геном STE13, отщепляет от белка оставшийся пептидный спейсер, после чего гетерологичный белок (в нашем случае – предшественник инсулина) высвобождается в межклеточное пространство (см. рис. 5) [Ostergaard S et al.2000].

mr0100001007

Рис.5. Секреция гетерологичного белка (инсулина) клетками дрожжей, в ходе которой происходит отщепление препептида сигнальной пептидазой, пропептида – Kex2-эндопротеазой и пептидного спейсера – дипептидиламинотрансферразой (Ste13). Первоначально применялась полная препролидерная последовательность -фактора со спейсером, имеющим структуру Glu-Ala-Glu-Ala. Однако такой спейсер плохо удалялся дипептидиламинопептидазой, в результате чего получаемый продукт содержал большую долю примеси Glu-Ala-Glu-Ala-предшественника инсулина. В одном из исследований оказалось, что, если направленным мутагенезом удалить спейсер из структуры лидерной последовательности, вышеупомянутой проблемы можно избежать. Некоторые исследователи, напротив, полагали, что присутствие спейсера необходимо, так как способствует более эффективному процессингу Kex2. Недостаточная «работа» этого фермента приводит к гипергликозилированию белка, что значительно снижает выход инсулина. В конце концов, были созданы спейсеры, более протяженные по длине, эффективно удаляемые трипсином и лизин-специфичной протеазой I, и это позволило в два раза повысить выход предшественника инсулина.

Другой подход к повышению эффективности синтеза инсулина в клетках дрожжей – создание синтетических лидерных последовательностей. Такие «лидеры» могут увеличить выход предшественника инсулина с «правильной» трехмерной структурой, так, что он превысит выход, наблюдаемый при использовании препролидера -фактора. Этот эффект коррелирует с увеличением времени нахождения белка в эндоплазматическом ретикулуме, что, видимо, способствует формированию правильной пространственной конформации инсулина (т.е. белок получает дополнительное время на то, чтобы успеть нужным образом «свернуться»). Кроме того, выход продукта повышает исключение сайтов N-гликозилирования из синтетических лидерных последовательностей (чего не наблюдается в случае использования -факторного препролидера). Также можно синтезировать лидерные последовательности, лишенные сайта распознавания Kex2 – в этом случае дрожжи будут секретировать предшественник инсулина, соединенный с пролидерной последовательностью, отщепление которой осуществляется in vitro. Преимущество этого подхода состоит в том, что синтетический пролидер может увеличить стабильность и растворимость «объединенного» белка, создав наиболее благоприятные условия для его последующей очистки и «созревания».

Аналоги инсулина

Аналогами инсулина называют белки, полученные путем модификации структуры молекулы нормального человеческого инсулина. Такой, модифицированный путем генной инженерии, инсулин обладает несколько иными – более предпочтительными в клинической практике - биологическими и фармакодинамическими свойствами. Первый аналог - инсулин лизпро - был введен во врачебную практику в 1996 году. Через 4 года эндокринологи смогли взять на вооружение два других рекомбинантных аналога - инсулин гларгин и инсулин аспарт.

Прежде всего, зададим вопрос: для чего понадобились рекомбинантные аналоги инсулина? Вспомним, что у здорового человека после приема пищи концентрация инсулина в крови быстро повышается, достигая максимума через 30-45 мин и возвращаясь к базальному уровню через 2-3 часа. Фармакокинетические характеристики препаратов человеческого инсулина таковы, что практически невозможно достигнуть устойчивой нормогликемии. При подкожной инъекции короткодействующий препарат человеческого инсулина «правильной» структуры слишком медленно начинает действовать и действие его длится дольше по сравнению с тем, как это происходит у здорового человека (так происходит из-за того, что молекулы инсулина начинают формировать димеры и гексамеры, что мешает им быстро абсорбироваться из места инъекции). В результате этого может наблюдаться ранняя постпрандиальная гипергликемия и повышается риск гипогликемии перед следующим приемом пищи. В случае же использования препаратов человеческого инсулина средней продолжительности или длительного действия, как правило, не удается достичь идеально стабильного базального уровня инсулина в крови. При их применении достигается нежелательный пик концентрации через 3-4 часа после инъекции, а, кроме того, биодоступность таких препаратов значительно варьирует у разных людей и даже у одного и того же человека. Таким образом, возникла необходимость в создании аналогов инсулина с измененными свойствами: с более быстрым началом и меньшей продолжительностью действия для препаратов короткого действия и более плоской кривой «время-эффект» и менее «изменчивой» биодоступностью для препаратов продленного действия.

Аналоги инсулина короткого действия.

Итак, путем внесения небольших изменений в аминокислотную последовательность молекулы инсулина (см. рис.6) удалось добиться снижения «стремления» молекул агрегировать и образовывать димеры и гексамеры, за счет чего повысилась скорость их абсорбции, что означает более быстрый эффект и меньшую продолжительность действия.

i_1_18Рис.6. Структура человеческого инсулина Инсулин Asp (B10). Это один из первых аналогов инсулина, предложенный к клиническому применению. В его молекуле аминокислота гистидин в 10 позиции В-цепи заменена на аспарагин, а отличительной особенностью является быстрая абсорбция (в 2 раза быстрее обычного инсулина). В ходе исследований этого аналога выяснилось, что замена единственной аминокислоты привела к изменению трехмерной структуры белка, что отразилось на его взаимодействии со своим рецептором, а именно: повысилась афинность к рецептору инсулина и ИФР-1 и снизилась скорость диссоциации. Таким образом, метаболический инсулина Asp превышал таковой обычного инсулина. И все бы хорошо, если бы не повышенная митогенная активность этого аналога, выявленная на некоторых клеточных линиях, а когда оказалось, что инсулин Asp повышает частоту аденокарциномы у животных, его дальнейшие испытания и вовсе прекратили.

Инсулин лизпро (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN). Участок В26-30 молекулы инсулина не играет роли в связывании с рецептором, однако важен для образования инсулиновых димеров. Это значит, что любые изменения в этом участке не повлияют на связывание с рецептором, но могут снизить тенценцию молекул гормона к димеризации, что повысит скорость абсорбции.

Инсулин лизпро оказался первым генноинженерным аналогом инсулина, введенным в клиническую практику. Он был получен путем реверсии пролина в 28 позиции и лизина в 29 позиции В-цепи, что заметно снизило способность молекул к ассоциации друг с другом, не повлияв на аффинность к рецептору инсулина. И хотя, аффинность к рецепотору ИФР-1 несколько повысилась, это не привело к повышению митогенной активности аналога по сравнению с нормальным инсулином. Было также показано, что иммуногенность инсулина лизпро не отличается от обычного инсулина. Более того, некоторые пациенты с резистентностью к нормальному человеческому инсулину вследствие формирования антител могли, тем не менее, успешно применять инсулин лизпро.

Инсулин аспарт [NovoLog (Novo Nordisk, Princeton, NJ)]. Другим примером изменения аминокислотной последовательности инсулиновой молекулы с целью создания короткодействующего аналога инсулина является инсулин аспарт (Asp B28), в котором замена пролина в 28 позиции В-цепи на аспарагиновую кислоту привела к снижению способности молекул к димеризации. Этот аналог инсулина был одобрен к клиническому применению в июне 2000 года в США. Кинетика взаимодействия инсулина аспарт с рецепторами к инсулину и ИФР-1 полностью аналогична таковой нормального инсулина, однако его аффинность к рецептору ИФР-1 несколько снижена. Инсулин аспарт абсорбируется в два раза быстрее обычного инсулина и достигает в два раза большей максимальная концентрации в крови, в то время как продолжительность его действия меньше. Таким образом, даже при введении этого аналога непосредственно до еды, постпрандиальный уровень глюкозы будет меньше, чем при введении обычного инсулина за 30 мин до еды. Кроме того, снижается риск поздней постпрандиальной гипогликемии. Аналоги инсулина длительного действия.

В настоящее время интенсивно изучается проблема преобразований молекулярной структуры инсулина с тем, чтобы замедлить и стабилизировать кинетику абсорбции с целью создания препаратов длительного действия. Один из способов пролонгировать действие инсулина – поднять его изоэлектрическую точку с рН 5,4 до нейтральных значений, путем разработки аналогов с большим числом положительно заряженных аминокислот в молекуле. Тогда молекулы становятся менее растворимыми в нейтральной среде, и подкожная инъекция такого аналога приведет к кристаллизации молекул в месте инъекции, что замедлит их абсорбцию в системный кровоток.

NovoSol Basal (Novo Nordisk). NovoSol Basal (B27Arg, A21Gly, B30Thr-Nh3) - первый аналог инсулина длительного действия, созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Оказалось, что его период полувыведения превышает таковой инсулина Ультратард НМ (Novo Nordisk) – одного из наиболее длительно действующих препаратов, однако из-за низкой биодоступности для достижения адекватного контроля уровня глюкозы в крови требовались в два раза большие дозировки этого аналога. Кроме того, несмотря на небольшой уровень интраиндивидуальной вариабельности его эффекта, уровень интериндивидуальной вариабельности (т.е. вариабельности между различными индивиуумами) оставался высоким. Вследствие этих причин, дальнейшие испытания NovoSol Basal были прекращены.

Инсулин гларгин [HOE 901, LANTUS (Aventis Pharmaceuticals, Parsippany, NJ)]. Этот биосинтетический аналог инсулина длительного действия был введен в клиническую практику в апреле 2000 года в США и в июне того же года в Европе. Инсулин гларгин был получен путем элонгации С-конца В-цепи молекулы инсулина посредством добавления двух остатков аргинина, а также замены аспарагина в 21 позиции А-цепи на глицин (A21Gly, B31Arg, B32Arg). Эти модификации привели к сдвигу изоэлектрической точки с рН5,4 к рН6,7, что сделало это аналог менее растворимым при физиологических значениях рН. Кроме того, замена аспарагина на глицин увеличила его биодоступность, благодаря чему, в отличие от NovoSol Basal, инсулин гларгин был одобрен для клинического применения. После инъекции эффект инсулина гларгин длится в течение 24 часов без выраженного пика концентрации в крови, и действует он «мягче» и с меньшей вариабельностью, чем НПХ-инсулины (НПХ это аббревиатура названия белкового пролонгатора - "Нейтральный Протамин Хагедорна"). Другое преимущество этого аналога в том, что если для НПХ-инсулинов эффект зависит от места введения, для инсулина гларгин такой зависимости выявлено не было.

Ацилированные инсулины. Другой способ пролонгировать эффект инсулина – «заставить» его связываться с белками плазмы. Как известно, некоторые гормоны обладают способностью связываться с белками-переносчиками в плазме, что продлевает их период полувыведения. Достигнуть этого можно путем соединения молекулы инсулина с неэстерифицированной жирной кислотой (т.е. ацилированием), которая, в свою очередь, может связываться с альбумином. Поскольку альбумин всегда присутствует в подкожной тканевой жидкости, связывание инсулина с этим белком значительно замедлит скорость его абсорбции и пролонгирует действие. Ацилирование молекулы инсулина обычно производят по остатку лизина в 29 позиции В-цепи. Такой аналог – инсулин детемир (Levemir), в частности, был разработан фирмой Novo Nordisk. Инсулин детемир (LysB29-tetadecanoyl, des(B30)-insulin) был одобрен к применению в Европе с июля 2004 года, а в США в 2006 году. Время абсорбции этого аналога из места введения превышает таковое у НПХ-инсулинов, а интеридивидуальная вариабельность эффектов ниже. Также по сравнению с НПХ-инсулинами нет выраженного пика концентрации в крови, характерно более медленное начало действия. Инсулин детемир имеет меньшую аффинность связывания с рецептором инсулина (и проявляет меньший эффект по сравнению с обычным инсулином при введении в эквимолярной дозе), но диссоциирует дольше. Было показано также, что связывание этого аналога инсулина с альбумином происходит независимо от связывания с альбумином других лекарственных препаратов, что значительно снижает вероятность лекарственных взаимодействий.

РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ

  • Синтез инсулина бактериальными клетками
  • Получение инсулина из клеток дрожжей.
  • Модификация нормального человеческого инсулина
Синтез инсулина бактериальными клетками
    • Получение гормона
    • Помещение гена гормона в вектор
    • Введение вектора в бактерию
    • Селекция бактерий, содержащих рекомбинантные гены
Синтез инсулина клетками дрожжей S. сerevisiae
    • Добавление лидерной последовательности к гену инсулина
    • Отщепление пре-региона в ЭПР дрожжей
    • Отщепление про-региона в аппарате Гольджи дрожжей
    • Отщепление спейсера
    • Секреция рекомбинантного гормона дрожжами
Модификация человеческого инсулина

Аналоги инсулина

Аналоги инсулина короткого действия

    • Инсулин лизпро
    • Инсулин аспарт
Аналоги инсулина длинного действия
  • Инсулин гларгин
  • Инсулин детемир

Поделитесь с Вашими друзьями:

zodorov.ru

С помощью какого метода биотехнологии получили человеческий инсулин

Я искала С ПОМОЩЬЮ КАКОГО МЕТОДА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧИЛИ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ИНСУЛИН. НАШЛА! 2. Получение инсулина в биотехнологии. 3. Способы получения инсулина человека. . Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому.Мировой рынок продукции медицинской биотехнологии бурно развивается. . Инсулин животных аналогичен человеческому, разница заключается в том, что в молекуле инсулина . В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. . В 1963 г. молекулу инсулина синтезировали с помощью биохимических методов.Получение инсулина. Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и . В Швеции лабробласты выращивали в ферментёрах объёмом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител. С помощью какого метода биотехнологии получили человеческий инсулин- ПРОБЛЕМЫ БОЛЬШЕ НЕТ!

Инсулин животных аналогичен человеческому, разница заключается в том, что в молекуле инсулина свиньи в отличие от человеческого в одной из цепей аминокислота треонин замещена аланином. . Сначала с помощью специальных методов определили строение молекулы . Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины. . Значение биохимии в биотехнологии.Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. . . по Дисциплине «Теоретические основы биотехнологии» на тему:«Лекарственные препараты, получаемые биотехнологическими методами.После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. . Поэтому в дальнейшем был разработан метод получения проинсулина человека целиком, с последующей его трансформацией в инсулин in vitro.Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой . В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого . 7. Основы фармацевтической биотехнологии:Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В. С помощью какого метода биотехнологии получили человеческий инсулин- 100 ПРОЦЕНТОВ!

С.Производство человеческого инсулина основано на методе генной инженерии, в . Инсулин в картриджах предназначен для введения с помощью, так называемых . органы животных, а также биотехнологии, позволяющие получать вещества.При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. . С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт.Изобретение относится к получению биологически активной IL-1 протеазы с помощью технологии . Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания лекарственных препаратов человеческого инсулина.Биотехнологии:сельскохозяйственные производства и промышленная . Исследования двух однокомпонентных инсулинов (человеческого и свиного) . С помощью этого метода был получен высокий выход гормона -200 г на 1000 л.Варианты получения биотехнологического инсулина. Рекомбинантные белки и пептиды. Скачать презентацию. . Недостатки подобного метода:надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры.Определите методы биотехнологии, с помощью которых получают различные вещества. . Список веществ:1) биосоляр. 2) человеческий инсулин.На данный момент, весь инсулин результат бактериальной деятельности. . Бесплатная помощь с домашними заданиями.Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой . В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого . 7. Основы фармацевтической биотехнологии:Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С.Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой . В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого . 7. Основы фармацевтической биотехнологии:Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С.Получение инсулина в биотехнологии. Инсулин, пептидный гормон островков . Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. . При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная . В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью.Получены дрожжи-продуценты нормального человеческого инсулина, а с помощью методов белковой инженерии созданы продуценты . Использование новой биотехнологии в значительной мере удешевило инсулин, а потенциальные.Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки. . Список литературы. 1. Биотехнология:Учебное пособие для ВУЗов /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.•3.5. Биотехнология получения вторичных метаболитов. . В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина . С помощью бромциана химер ный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энк4 фалин.http://www.greenmama.ru/nid/3421867/http://www.greenmama.ru/nid/3426937/http://www.greenmama.ru/nid/3435596/

www.greenmama.ru

Биотехнология в производстве лекарственных препаратов

Получение инсулина в биотехнологии

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса подже­лудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллерги­ческих реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапев­тическое применение инсулина сдерживалось его высокой стои­мостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модифи­кации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.[8]

Компания EliLilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coliе А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании гена проинсулина — предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.

К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о про­мышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной систе­мы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном примене­нии эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внима­ние, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодр­ствования. Примером успешного применения методов генетиче­ской инженерии может служить синтез р-эндорфина по техноло­гии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина.[7]Способы получения инсулина человека:

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического. [9]

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом .

В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации). [9]

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

1) белок носитель - обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

2) аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта. [10]Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli..

В работе использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину. Другая группа исследователей получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Также сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы. [13]

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида- носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе. [14]Очистка инсулина.

Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13]. Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина. Сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе  исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд. [12]

В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина, структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 - 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. Сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения, представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.

Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, трансфицировали кДНК белка переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins. В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа "искусственной b-клетки", полученной методами генной инженерии. [12]

Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида показано наличие биологической активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях наряду с инсулином. В следующих статьях этой серии будут рассмотрены физико-химические и биологические свойства С-пептида, а также методы его получения.

Значителен вклад биотехнологии и в промышленное произ­водство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Ме­тоды микробиологической трансформации позволили резко со­кратить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артри­та. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacterglobiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Име­ются разработки по получению гормона щитовидной железы ти­роксина из микроводорослей.[14]4. Получение интерферонов, интерлейкинов, факторов крови

Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфицирование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стиму­лируют деятельность иммунной системы и препятствуют размно­жению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интер­феронов важны с точки зрения их терапевтического применения.[2]

Получение интерферонов

Различают a-, b-, g- и e-интерфероны, образуемые соответст­венно лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы. Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, b - и g-интерфероны связаны с остат­ками сахаров (гликозилированы). До введения методов генети­ческой инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для инъекции.

Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами.

Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.[3]

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.[5]

Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.[10]

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).

Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.[11]

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии. [11]

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.

Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.

4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка [4].

5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека.

В настоящее время a-, b- и g-интерфероны успешно получают с применением генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, куль­тивируемых клеток насекомых (Drosophila) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть очищены с использо­ванием моноклональных антител. В случае у- и р-интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, на­пример Bioferon (ФРГ), используют не генноинженерные мутан­ты, а культивируемые invitro фибропласты человека.

Интерфероны используются для лечения болезней, вызывае­мых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловирусом- вирусом, вызывающим опасное поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание аэрозоля ин­терферонов позволяет предупредить развитие острых респиратор­ных заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в частности a-интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении интерферонов, необходимом для лечения злокаче­ственных опухолей.[13]

Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди, кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме. Два последних заболевания харак­терны для лиц, страдающих приобретенными иммунодефицитами. Интерфероны полезны также при лечении рассеян­ного склероза.

Методы генетической инженерии позволяют получать модифи­цированные Интерфероны. Антивирусная активность интерферо­нов варьирует при аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания CetusCorporation производит b-интер-ферон, в аминокислотной последовательности которого цистеин в положении 17 замещен на серии. Это приводит к повышению терапевтической активности препарата, так как предотвращает наблюдаемое invitro формирование неактивного димера b-интер-ферона за счет дисульфидных связей между остатками цистеина в положении 17. Определенные надежды возлагают на модифи­кацию интерферонов путем получения гибридных молекул (Е. Д. Свердлов, 1984).    продолжение

www.coolreferat.com

Производство инсулина, ОАО «Национальные биотехнологии»

 

ОАО «Национальные биотехнологии» располагает уникальной технологической линией для производства генно-инженерных препаратов бактериальной природы. На основе разработанной технологии спроектирована опытно-промышленная линия по производству генно-инженерного инсулина человека мощностью 30 кг субстанции и 1 000 000 флаконов готовых лекарственных форм в год.

В ближайшем будущем планируется выпуск следующих субстанций лекарственных средств:

- альфа-2б-интерферон

- гормон роста

- гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

- гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

 

Участки основного производства:

-           Участок биосинтеза

-           Участок очистки инсулина

-           Участок приготовления растворов и обработки стоков

-           Участок готовых лекарственных форм

-           Производственнаялаборатория

-           Научно-исследовательская лаборатория

 

 

Оборудование, поставленное компанией Bioengineering AG.

В 2000 году по техническому заданию, подготовленному специалистами нашей фирмы, компания Bioengineering AG изготовила и поставила технологическую линию состоящую из трёх ферментёров объёмом 15, 150 и 1500 литров. Ферментёры полностью удовлетворяют нашим требованиям, которые сформулированы в техническом задании. Культивирование микроорганизмов продуцентов инсулина является высокотехнологическим производством, поэтому нами было выдвинуты соответственно высокие требования к оборудованию.

 

  

Компания BioengineeringAG оснастила ферментёры необходимыми агрегатами и датчиками для обеспечения полной автоматизации всех основных параметров культивирования.

Параметрами культивирования являются:

-        Автоматическое термастатирование ферментации. PID контроль

-        Автоматическая поддержка кислотного баланса питательной среды (рН), интегральная система поддачи кислоты и щёлочи.

-        Автоматическое поддержание уровня растворённого кислорода в питательной среде (рО2), каскадный контроль оборотами мешалки, подачи воздуха и давлением в ферментёре.

-        Автоматическое регулирование подачи воздуха в ферментёр по сигналу MassFlow-meter.

-        Автоматическое поддержание давления в ферментёре.

-        Контроль за уровнем пены. Ферментёры оснащены системой механического пеногашения и интегральной системой подачи химического пеногасителя.

 

Ферментёры оснащены датчиками объёма питательной среды и датчиками мутности, что повысило информативность процесса культивирования. Благодаря программному обеспечению, мы имеем возможность, полностью автоматизировать процесс стерилизации ферментера и всех необходимых узлов, а так же автоматизировать процесс управления культивированием.

По нашим требованиям ферментёры были сконструированы таким образом, что они обеспечивают необходимые нам массообменные характеристики. Ферментационная линия даёт возможность использования всех 3-х единиц в автономном режиме. Подобие конструкции культиваторов и их массообменных характеристик обеспечило отработку и масштабирование всех технологических процессов выращивании микроорганизмов.

 

 

 

Специалистами фирмы BioengineeringAG был проведен шефмонтаж оборудования и настройка программ, необходимые для автоматизации процесса культивирования.

Благодаря ферментёрам BioengineeringAG, мы имеем возможность, наилучшим образом оптимизировать процесс культивирования микроорганизмов, продуцентов инсулина, что привело к уменьшению себестоимости конечного продукта и повышению доходности предприятия.

 

 

Закрытое акционерное общество «Национальные биотехнологии» было образовано 4 декабря 1998 г. и зарегистрировано в Московской областной регистрационной палате (регистрационный номер 50:32:00354). Основной государственный регистрационный номер 1025007770446 от 01.10.02 г. регистрирующий орган – Межрайонная инспекция № 6 по Московской области.

В 2003 г. ЗАО «Национальные биотехнологии» перерегистрировано в Открытое акционерное общество «Национальные биотехнологии» (ГРН № 2035011804100 от 07.07.2003 г.)

Полное фирменное наименование Общества - Открытое акционерное общество «Национальные биотехнологии»; на английском языке - Joint-Stock «National biotechnology». Сокращенное наименование Общества на русском языке - ОАО «Национальные биотехнологии», на английском языке - «National biotechnology» Company.

В настоящее время в компании занято 160 человек.

 

Основная деятельность предприятия состоит в производстве генно-инженерного инсулина человека и проведение научных исследований в области генной инженерии.

ОАО "Национальные биотехнологии" обладает патентами на штамм-продуцент инсулина и технологический процесс производства ГИИЧ (патент № 2141531, патент № 2144957, патент № 2232813, патент № 2263147, патент № 2143493)

 

Основные направления деятельности и перспективы развития.

Общество осуществляет следующие основные виды деятельности:

-        Осуществление научной и (или) научно-технической деятельности, подготовку научных работников;

-        Совершенствование технологии и производство лекарственных средств и изделий медицинского назначения, в том числе генно-инженерного инсулина человека:

-        Разработка нормативно-технической и технологической документации необходимой для промышленной организации производства субстанции и готовых лекарственных средств, изделий медицинского назначения, в том числе лекарственных форм генно-инженерного инсулина человека. Организация промышленного производства лекарственных средств, в том числе и генно-инженерного инсулина человека;

-        Разработка исходных данных на строительство мощностей по производству лекарственных средств и изделий медицинского назначения, в том числе генно-инженерного инсулина человека;

-        Оказание информационных и консультационных услуг, услуг по рекламе, маркетингу, консалтингу, лизингу и инжинирингу;

-        Проведение научно-исследовательских и опытно-конструкторских - работ в области современных медицинских технологии;

-        Распространение (реализация) через розничную и оптовую сеть, аптечные киоски общества лекарственных препаратов, субстанций, фармацевтических и косметических композиций на их основе, медицинской аппаратуры и оборудования, изделий медицинского назначения;

-        Получение, хранение, оптовая и розничная реализация лекарственных средств, включая фармацевтические субстанции, и изделий медицинского назначения;

-        Производство и реализация лекарственных средств, субстанций, изделий медицинского назначения, медицинской техники;

-        Осуществление строительства, капитального и текущего ремонта, в том числе подрядным и хозрасчетным способом;

-        Внешнеэкономическая деятельность;

-        Экспортные операции - продукция и услуги в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации;

-        Импортные операции - закупка медицинского оборудования, машин, сырья, технологий, продукции и товаров народного потребления, продуктов питания для развития собственного производства и для реализации населению и предприятиям.

 

bio-rus.ru


Смотрите также