Генно-инженерный инсулин. Генно инженерные инсулины


генно-инженерный инсулин

генно-инженерный инсулин

Инсулин призван обеспечить проникновение глюкозы сквозь мембраны клеток организма. Если внутрь питательные вещества поступать не смогут, клетки погибнут от голодания, а уровень сахара в крови человека начнет зашкаливать, отравляя тем самым организм.

Особенности использования генно-инженерного инсулина

Во второй половине девятнадцатого века выдающийся русский ученый Соболев сделал открытие. Он доказал, что именно инсулин, специальный гормон, отвечает за уровень сахара в крови. Но только в 1922 году больной диабетом ребенок получил искусственную дозу. Результаты получились такими впечатляющими, что уже через год производителем из США был выпущен промышленный препарат, полученный из организма животных.

Генно-инженерный инсулин стал предметом повышенного интереса исследователей. Его действие старались оптимизировать, и изобрести формулу пролонгированного инсулина удалось уже в середине прошлого века.

Инсулинотерапия стала общепринятой практикой в лечении диабета, а многим больным удалось спасти жизни. Ученые работали над такими проблемами, как очистка инсулина. Ведь применение именно человеческого инсулина обеспечивает минимум аллергических проявлений, предотвращая нежелательные последствия.

Способы получения генно-инженерного инсулина

В настоящее время инсулин получают несколькими способами:

  • Химический синтез и экстракция из организма человека.
  • Полусинтетический метод. Это вмешательство в молекулярное строение свиного инсулина.
  • Биосинтетический метод. Он предполагает применение генно-инженерных способов и является наиболее эффективным.

Биосинтетический метод – это выработка проинсулина, который затем получает преобразования, становясь гормоном в активной форме. Это самый популярный и распространенный подход, который позволил сделать инсулин эффективным и доступным для страдающих от диабета пациентов.

Препараты, содержащие генно-инженерный человеческий инсулин

Как известно, инсулин бывает трех разновидностей: короткий, средний и длинный. Короткий инсулин представлен такими препаратами, как Актрапид-НМ, а также Хумулин-Р Актрапид и Актрапид-МС.

Длинный инсулин – это Ультраленте Ультратард (человеческий и бычий), а также Монотард-НМ и Ленте-МС Ленте (человеческий, свиной и бычий).

В настоящее время инсулин – это самое распространенное, радикальное и зачастую единственное средство помочь людям, страдающим от диабета. Трудно представить, что сто лет назад пациентов, у которых был выявлен диабет, ожидала неминуемая гибель на протяжении двух лет, причем их не могла спасти никакая диета.

 

diabetanety.com

Инсулин генно-инженерный - Справочник химика 21

    В последние годы для крупномасштабного получения труднодоступных пептидов все более широкое распространение получают методы генной инженерии (технологии рекомбинантных ДНК). Некоторые из белков (инсулин, гормон роста), полученных этим методом, абсолютно идентичны природным белкам человека. Другое вещества, например гликопротеин эритропоэтин, идентичны нативным веществам по структуре полипептидной цепи, но немного отличаются от них по строению боковых углеводных цепей в зависимости от продуцирующей линии животных клеток. Получение белков и некоторых гликопротеинов в качестве стандартов генно-инженерным путем наиболее удобно в случае труднодоступных объектов (интерлейкины 1а и ренин, интерфероны человека). Проблемы контроля производства и детального исследования свойств рекомбинантных продуктов рассмотрены в работах [11, 12]. [c.35]

    Соматотропин — гормон роста — играет существенную роль в постнаталь-ном развитии организма, контролируя многие стороны углеводного, липидного и минерального обменов. Дефицит гормона приводит к карликовости, лечение которой проводится посредством соматотропинотерапии. В отличие от инсулина соматотропин обладает видовой специфичностью, и до недавнего времени его выделяли из гипофиза трупов. Выраженная гетерогенность этого гормона негативно сказывалась на его фармакологическом эффекте. Получение генно-инженерного соматотропина явилось решением проблемы обеспечения медицины этим препаратом. [c.502]

    Значение инженерной энзимологии, как и вообще биотехнологии, возрастет в будущем. По подсчетам специалистов, продукция всех биотехнологических процессов в химической, фармацевтической, пищевой промышленности, в медицине и сельском хозяйстве, полученная в течение одного года в мире, будет исчисляться десятками миллиардов долларов к 2000 г. В нашей стране уже к 2000 г. будет налажено получение методами генной инженерии Ь-треонина и витамина В,. Уже к 1998 г. предполагается производство ряда ферментов, антибиотиков, О -, 3-, у-интерферонов проходят клинические испытания препараты инсулина и гормона роста. Гибридомной техникой в стране налажен выпуск реактивов для иммуно-ферментных методов определения многих химических компонентов в биологических жидкостях. [c.165]

    Инсулин человека, полученный с помощью Е, oli, оказался первым генно-инженерным белком, испытанным на людях. В опытах со здоровыми добровольцами было установлено, что он безопасен, во всяком случае при краткосрочном применении (не вызывает аллергических и иных нежелательных реакций) и обладает практически одинаковой с инсулином свиньи способностью снижать уровень глюкозы в крови при введении его под кожу или внутривенно (рис. 8.4). В настоящее время такой [c.337]

    В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

    Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

    Инсулин играет основную роль в лечении диабета — болезни, по распространенности занимающей третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Получение этого гормона генно-инженерным способом представлялось весьма перспективным и было выполнено в начале 80-х гг. XX столетия. В качестве компетентной клетки использовали Е. соИ, гены обеих цепей молекулы человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к З -концу гена, кодирующего белок р-галакто-зидазу, и вводили в векторную плазмиду Трансформированные клетки Е. соИ [c.501]

    Во-вторых, это станет приговором миллионам пациентов, живущим лишь за счет лекарств, полученных методами биотехнологии (например, генно-инженерного инсулина). Об этом мало говорят и пишут, но генную инженерию лишь на 10% применяют в сельском хозяйстве, а на 90% — в медицине. [c.74]

    Уже в 1982 г поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусственно встроенную генетическую информацию об этом гормоне На таком же уровне или с близким к тому заделом находятся следующие генно-инженерные препараты интерфероны, фактор некротизации опухоли (TNF), интерлейкин-2, соматотропный гор- [c.17]

    Ярким примером успехов в этой области является фирма Ге-нетех . Созданная на скромные инвестиции в 1976 г. при участии Г. Бойера — одного из пионеров генетической инженерии, она сейчас занимает лидирующие позиции в создании препаратов медицинского назначения. Уже в 1977 году сконструирован штамм Е. соИ, синтезирующий человеческий белок (somatostatin). В 1978 году клонирован ген человеческого инсулина, в 1979 году — ген человеческого гормона роста. Тщательная процедура клинической проверки генно-инженерных продуктов позволила уже в 1982 году получить разрешение на использование для лечения рекомбинант- [c.11]

chem21.info

способ получения генно-инженерного инсулина человека - патент РФ 2322504

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета. Способ осуществляют путем культивирования штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушения клеток дезинтеграцией, отделения телец включения, содержащих гибридный белок. Далее проводят предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией. Расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина - кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий последовательность двух синтетических IgG связывающих доменов стафилококкового белка А. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "Integrated production of human insulin and its C-peptide", Journal of biotechnology, 1996, v.48, p.241-250).

Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Coli ДН5 а / pVK100, разрушают бактериальные клетки ультразвуковой дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, в течение 12-16 часов. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 37°С в течение 1 часа. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят pH до 4,5 и выдерживают 2 часа при 4°С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при pH 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером pH 10,8 и выдерживают при 4°С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис-HCl буфере, pH 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (соотношение карбоксипептидаза Б:трипсин:гибридный белок 0,3:1:10) при 37°С в течение 30 минут. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонке с DEAE-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис-HCl буфером, pH 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают pH до 2,0 и собирают осадок инсулина.

(Chen J.-Q., Zhang H.-T., Hu М.-Н., Tang J.-G., "Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor" Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p.5-15).

К недостаткам известного способа относится применение гель-фильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большое количество ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией белка линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией (Пат. РФ №2141531, МКИ С12Р 21/02, опубл. 1999 г.)

К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины и органических растворителей на стадии очистки гибридного белка.

Известен способ получения инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 в промышленном ферментере объемом 200-1500 л, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем 8 М мочевину и дитиотреитол в течение 10-12 часов, ренатурацию, разбавление в 5-10-кратном объеме 0,1 М Na-глицинового буфера при pH 9-11 и 10-14°С, очистку ренатурированного гибридного белка после кислотного осаждения и микрофильтрации хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 М трисовым буфером с pH 7,0-7,5, элюированием гибридного белка исходным буфером, содержащим 0,25 М хлористого натрия и 1,5 М мочевины, последовательное расщепление гибридного белка сначала трипсином в соотношении трипсин : гибридный белок 1:(500-100), а затем карбоксипептидазой Б в соотношении фермент : гибридный белок 1:(500-1000), при этом промежуточные продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0, содержащим 3 М мочевину, и элюцией белка линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере. Полученный после гидролиза инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, фракции с чистотой инсулина не менее 98% объединяют, осаждают 10% уксуснокислым цинком при pH раствора 6,3-6,5, осадок центрифугируют, растворяют в 1 М растворе уксусной кислоты и подвергают гель-фильтрации, а целевой продукт кристаллизуют (Пат. РФ №223813 от 18.02.2003, опубл. 20.07.2004).

К недостаткам способа следует отнести многостадийность процесса, связанную с раздельным гидролизом гибридного белка, использование больших количеств трипсина и карбоксипептидазы Б и значительных количеств мочевины и растворителя на стадиях очистки продукта.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА в течение 3-7 часов, очистку регенерированного гибридного белка в одну стадию ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:(1-2):1, очистку инсулина гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка.

(Пат. РФ №2208637, МКИ С12N 15/00, опубл. 2003 г.)

К недостаткам способа следует отнести низкий выход целевого продукта и большую продолжительность процесса.

Изобретение решает задачу повышения выхода инсулина и сокращения длительности процесса.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения генно-инженерного инсулина человека, включающем ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 часов, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.

Техническим результатом изобретения является повышение выхода конечного продукта до 120-180 г фармакопейной субстанции инсулина человека с 1000 л культуральной жидкости по сравнению с 50 г с 1000 л в известном способе и сокращение времени проведения процесса на 24 часа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения генно-инженерного инсулина человека используют штамм-продуцент гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL 21PINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07.

Биосинтез продуцента проводят культивированием.

При культивировании клеток штамма-продуцента гибридного белка для получения инокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 20 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 1000 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-способ получения генно-инженерного инсулина человека, патент № 2322504 -D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:

1. Тельца включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трисом при pH 9,0.

2. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5-10 мМ дитиотреитола (ДТТ), при pH 8,0. Осадок отделяют центрифугированием.

3. Ренатурацию проводят следующим образом: супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ трисовым буфером с pH 9,5 при 6-9°С так, чтобы концентрация общего белка составила 0,7-0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 48 часов.

4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на DEAE-сефарозе.

5. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора до pH 3,0, прибавляют хлористый натрий, центрифугируют. Осадок инсулина передают на стадию очистки.

6. Очистка инсулина может выполняться двумя альтернативными способами:

а) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М, повышают pH до 6,6 и раствор наносят на колонку, упакованную гидрофобным сорбентом. Сорбированный материал элюируют этанолом в цитратном буфере в градиентном режиме. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку.

б) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте и наносят на препаративную колонну ОФ ВЭЖХ. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на дальнейшую очистку.

7. Готовят раствор инсулина в 0,5 М уксусной кислоте и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке с сефадексом G-50 SF SG.

8. Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-способ получения генно-инженерного инсулина человека, патент № 2322504 -D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2 М, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на центрифугах при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трис-буфере при температуре 6°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трис-буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,7 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну BPG 450 с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия при концентрации NaCl от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 98 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при массовом соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 6°С. Время проведения процесса 20 часов. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин осаждают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М, осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют посредством гидрофобной хроматографии низкого давления. Инсулин в количестве 120 г растворяют в 15 л раствора 10 мМ лимонной кислоты, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М и доводят pH до 6,6. Подготовленный таким образом раствор инсулина наносят на колонну с 30 л сорбента Butyl Toyopearl 650S, предварительно уравновешенную цитратным буфером с 0,5 М хлорида натрия, pH 6,6. Инсулин десорбируют этиловым спиртом в цитратном буфере (концентрация спирта от 10 до 23%). Фракции с чистотой инсулина 98% и выше объединяют и передают на следующую стадию. Материал с чистотой менее 98% возвращают на повторную очистку.

65 г очищенного инсулина осаждают 3 М хлоридом натрия, осадок центрифугируют и передают на стадию гель-фильтрации. Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции выделяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в выделенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, кристаллизуют в присутствии солей цинка с последующей сушкой под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м3 культуральной жидкости) составляет 120 г.

Пример 2.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli BL 21/pPINS07(BL07) проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-способ получения генно-инженерного инсулина человека, патент № 2322504 -D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2М, и разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на проточной центрифуге при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трисовом буфере при температуре 9°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трисовый буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,8 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия с концентрацией от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 100 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 9°С. Время проведения процесса 22 часа. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин высаживают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М. Через 20 часов осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют методом препаративной ОФ ВЭЖХ. Для очистки используют сорбент на силикагелевой основе с привитой фазой С8, размер частиц сорбента 15 мкм.

На колонну наносят 35 г инсулина, растворенного в 10 мМ лимонной кислоте. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония pH 3,0. Чистоту фракций контролируют ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на стадию гель-фильтрации.

Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в объединенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин осаждают ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина (после 2 циклов гель-фильтрации) составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м 3 культуральной жидкости) составляет 180 г.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 ч, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.

www.freepatent.ru