Типы инсулина и методы его получения (стр. 2 из 2). Методы получения инсулина


Способ получения инсулина

 

Сущность изобретения: способ получения инсулина из поджелудочной железы животных основан на сорбционной хроматографии с использованием носителей на основе силикагеля и макропористого стекла отечественного производства. Выделение инсулина из спиртового экстракта состоит из 4 операций, очистка включает 2 - 3 операции. По данным электрофореза в полиакриламидном геле инсулин, получаемый по предлагаемому способу, практически не содержит примесей белков (менее 0,1%). Выход - 25 мг из 1 л спиртового экстракта. Метод прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ из органов и тканей животных, конкретно к выделению и очистке инсулина из поджелудочной железы свиньи и крупного рогатого скота.

Инсулин является основным фармакологическим средством при лечении сахарного диабета. Ежедневные инъекции инсулина больным в течение длительного времени предъявляют жесткие требования к чистоте данного лекарственного средства. Даже незначительные примеси белковых компонентов вследствие кумулятивного эффекта в процессе лечения могут привести к летальному исходу. В лучших образцах импортного производства (фирма "Eli Lilly", США, фирма "Novo", Дания) содержание белков с молекулярным весом выше 6000 не превышает 1% . Однако, и столь малые примеси в препаратах инсулина могут вызывать аллергические реакции. Из-за низкого качества инсулина, получаемого в странах бывшего СССР, производство его на некоторых заводах прекращено. В настоящее время начальный этап выделения инсулина из поджелудочной железы животных является общепринятым и заключается в экстракции гормона из ткани с помощью этилового спирта высокой концентрации, подкисленного до рН 2,0-3,5, как правило, одной из сильных неорганических кислот. Дальнейшее выделение инсулина из спиртового экстракта имеет несколько решений. Известен способ выделения инсулина из спиртового экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, в котором инсулин сорбируется на макропористом сульфополистирольном катионите КУ-23 при рН 2,4 без предварительной депротеинизации экстракта (а.с. СССР N 389793). После сорбции смолу последовательно промывают 70%-ным этиловым спиртом и 0,2 М уксусно-аммонийным буфером рН 5,0-5,3. Элюцию инсулина со смолы проводят 0,2 М соляно-аммонийным буферным раствором рН 9,4-9,6, содержащим 15-20% этилового спирта. Элюат подкисляют до рН 2,0, осадок отфильтровывают. Фильтрат доводят конц. аммиаком до рН 4,4, выпавший осадок удаляют, а к супернатанту при рН 6,0 добавляют 10%-ный раствор ацетата цинка для осаждения аморфного цинк-инсулина. Активность целевого продукта составляла 24 МЕ/мг, выход - 2420 МЕ на 1 кг поджелудочной железы. Основным недостатком метода является довольно низкая активность получаемого продукта, что свидетельствует о возможном присутствии больших количеств примесных соединений. Вышеупомянутый метод содержит основные элементы выделения инсулина, используемые ранее в разработках различных фирм, однако, целевой продукт не удовлетворял требованиям, предъявляемым к данному лекарственному средству. Поэтому было разработано несколько вариантов очистки инсулина. По мнению Zoltobrocki (пат. США N 41295690) освободиться от примесных соединений (особенно от белков, близких по молекулярному весу и родственных белков - проинсулин, дезамидоинсулины, аргинин- и диаргинин-инсулины, этиловые эфиры инсулина) можно только с помощью ионно-обменной хроматографии с использованием в качестве элюентов систем, вызывающих диссоциацию компонентов смеси. В работе использовались водные буферы, содержащие неионные детергенты. Предпочтительными оказались аниониты типа DEAЕ- и QAE-Sephadex A-25, а среди детергентов лучшими свойствами обладали эфиры жирных спиртов и полигликоля. Фирмой "Eli Lilly" разработан способ очистки на сильном анионите, при котором снятие инсулина с сорбента осуществляют с помощью водно-спиртовых растворов рН 5,5-10,0 (ФРГ, пат. N 1966573).Одним из возможных вариантов очистки инсулина рассмотрена также хромотаграфия на декстрановом геле типа Sephadex с размером частиц 0,08-0,1 мм и элюцией 0,5 М уксусной кислотой (пат. США N 3878186). Это позволяет освободиться от высокомолекулярных белков, проинсулина и белков, близких к инсулину по молекулярной массе. В вышеупомянутых методах очистки инсулина в хроматографическом процессе собирают только центральную часть фракций, содержащих инсулин, что неизменно ведет к потере целевого продукта. Хорошие результаты по очистке инсулина были получены Jackson R.L. (пат. Англия N 2038340), который использовал последовательную хроматографию на анионите DEAE-Sephadex А-25, а затем на сильном катионите SP-Sephadex С-25, проводя элюцию гормона в градиенте хлоpистого натрия и присутствии 7 М мочевины. После обессоливания на Sephadex G-25 или Sephadex G-50, автору удалось практически полностью избавиться от примесей проинсулина, глюкагона и соматостатина. Надо отметить, что перечисленные методы являются дополнительными к основному процессу и, следовательно, усложняют и без того довольно громоздкую и дорогостоящую схему выделения целевого продукта. Известен также способ выделения инсулина [1], выбранный нами в качестве прототипа, в котором перед сорбцией инсулина на катионите проводится трехкратное удаление белка из спиртового экстракта. Первую депротеинизацию осуществляют с помощью хлористого кальция при рН 3,5-3,8. После отделения осадка фильтрат подщелачивают до рН 4,7-5,1 и вновь выпавший осадок убирают центрифугированием. В третий раз осаждение белков проводят в течение 2-3 часов при рН 3,7-3,9 и охлаждении смеси до 0-6o С. После отделения осадка фильтрат пропускают через колонку с сульфокатионитом КУ-23 и далее обработку ведут известным способом. Цинк-инсулин перекристаллизовывают из водного раствора лимонной кислоты, содержащем ацетон, и получают кристаллический инсулин с активностью 26,5 МЕ/мг. Выход составляет 4505 МЕ в пересчете на 1 кг поджелудочной железы. Основными недостатками метода являются: многостадийность, что делает его трудо- и энергоемким; значительное число операций проводится с большими объемами растворов, что затрудняет соблюдение санитарных норм производства; довольно низкая активность целевого продукта. Целью изобретения является разработка быстрого и дешевого способа выделения инсулина и повышения частоты целевого продукта с использованием только носителей и реактивов отечественного производства. Качество целевого продукта не должно уступать лучшим образцам зарубежных фирм, а по некоторым показателям и превосходить их. Поставленная цель достигается тем, что спиртовой экстракт поджелудочной железы, получаемый известным способом, подщелачивается до рН 6,0-9,5 и выпавший осадок удаляют центрифугированием. Супернатант подкисляют до рН 1,7-4,5 и наносят на колонку с сульфокатионитом. После сорбции колонку промывают последовательно 65% этиловым спиртом, водой и 0,3 М натрий-ацетатным буфером рН 5,0 - 5,3. Инсулин с колонки элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,5, содержащим 0,2-1,0 М хлорид натрия. Элюат подщелачивают до рН 7,5-9,5, добавляют хлорид натрия до концентрации 2,0-4,0 М. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в системе, содержащей 5-30% ацетонитрила рН 2,0-7,5 и наносят на колонку с носителем типа "Адан". Инсулин с колонки элюируют той же водно-органической системой с концентрацией органического растворителя от 10 до 50% и лиофильно высушивают. Сущность метода заключается в том, что на первой стадии выделения удаление из спиртового экстракта большого числа сопутствующих веществ проводится в щелочной области в один прием. Спиртовый экстракт подщелачивается с помощью 10 М гидроокиси натрия или калия или конц. аммиака до рН 6,0-9,5 и выпавший осадок удаляют центрифугированием. Супернатант подкисляют с помощью конц. раствора сильной кислоты (серная, соляная или фосфорная кислоты) до рН 1,7-4,5 и наносят на колонку с сильным катионитом. Для сорбции инсулина впервые использован сильный катионит на основе силикагеля. Диасорб-сульфо. После сорбции колонку отмывают от липидов сначала системой нанесения рН 1,7-4,5, а затем 65% раствором органического растворителя (в качестве органического растворителя можно использовать ацетонитрил, метиловый, этиловый, пропиловый и изобутиловый спирты), водой и балластные белки элюируют с колонки 0,3 М ацетатным буфером рН 5,0-5,3. Инсулин с колонки десорбируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,5, содержащим 0,2-1,0 М хлорид натрия. Элюат подщелачивают с помощью раствора гидроокиси натрия до рН 7,0-9,5 и добавляют хлдорид натрия до концентрации 2,0-4,0 М. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и после растворения хроматографируют на колонке с носителем "Адан". "Адан" является гидрофобным носителем на основе макропористого стекла и впервые используется для выделения и очистки инсулина. Для нанесения инсулина на колонку могут быть использованы как водные, так и водно-органические системы с концентрацией органического растворителя в диапазоне 5-30% в области рН 2,0-7,5. В качестве растворителя может использоваться тот же набор органических растворителей, что и в случае работы на колонке с сульфокатионитом. После промывки колонки системой нанесения гормон элюируется той же водно-органической системой, но с более высоким содержанием органических растворителей (от 10% до 50%). Элюат либо лиофильно высушивают, либо инсулин осаждают в виде цинковой соли после добавления 1%-ного раствора ацетата цинка. Для дальнейшей очистки препарат инсулина рехроматографируют на колонке с "Аданом" в тех же условиях. Чистоту получаемого продукта контролируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с использованием трицинового буфера (Anal.Biochem. 166,368-379, 1987). Гель фиксируют формальдегидом или глутаровым диальдегидом и окрашивают раствором азотнокислого серебра (в разработке авторов). Этот вариант проявления и фиксации геля имеет преимущество перед широко распространенным методом окрашивания с помощью Coomaccie G-250, поскольку он предотвращает вымывание с геля низкомолекулярных белков, легко растворимых в кислых водно-спиртовых системах, и позволяет обнаружить даже микропримеси таких компонентов (менее 0,2%). В предлагаемом способе выделения и очистки инсулина были использованы носители, приготовленные на основе силикагеля и макропористого стекла - катионит Диасорб-сульфо и гидрофобный носитель "Адан". Оба носителя отечественного производства и используются для выделения и очистки инсулина впервые. В отличие от сульфополистирольных носителей типа КУ-23 и Dowex 50х2 носители на основе силикагеля и макропористого стекла (Диасорб-сульфо и "Адан") апирогенны, что является большим преимуществом при использовании их в производстве лекарственных средств. Основные преимущества предложенного способа по сравнению с прототипом заключаются в следующем: сокращено количество операций - четыре операции при выделении и две операции при очистке целевого продукта, что в свою очередь значительно удешевляет весь процесс и сокращает время его проведения; после второй операции рабочие объемы уменьшаются практически в 10 раз, что упрощает технологию и облегчает соблюдение санитарных норм производства; количество энергоемких операций (центрифугирование, упаривание) сокращено до минимума; содержание сопутствующих белковых примесей в инсулине, получаемом по предложенному способу, по данным электрофореза в полиакриламидном геле ниже, чем в лучших образцах импортного производства. Метод прост в реализации и выполняется на носителях и с помощью реактивов отечественного производства, не требует дорогостоящего оборудования. В лабораторных условиях проведение всех операций по выделению целевого продукта, начиная с осаждения сопутствующих компонентов из спиртового экстракта и кончая лиофилизацией, занимает 3-4 дня. П р и м е р 1. Выделение инсулина крупного рогатого скота. К 1 л спиртового экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, полученного известным способом, с использованием фосфорной кислоты, добавляют конц. раствор аммиака, доводя рН до 6,0. Выпавший осадок удаляют центрифугированием, супернатант подкисляют конц. соляной кислотой до рН 2,7-3,0 и наносят на колонку (1,5х17 см), заполненную Диасорбом-сульфо и уравновешенную 65% -ным этиловым спиртом в 0,01 н. ацетате натрия рН 2,7-3,0, со скоростью 50 мл/ч. После сорбции колонку последовательно промывают той же системой, 65% -ным этиловым спиртом, затем 20%-ным хлороформом в 65%-ном этиловом спирте, 65% -ным этиловым спиртом и водой. Балластные белки удаляют промыванием колонки 0,3 М ацетатом натрия рН 5,0-5,3. Инсулин элюируют с колонки 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,2, содержащим 0,3 М хлорид натрия. К элюату добавляют сухой хлорид натрия с тем, чтобы конечная его концентрация составляла 2,8 М. Выпавшие кристаллы инсулина растворяют в 10%-ном водном растворе ацетонитрила рН 2,0-2,6. Нерастворившийся остаток удаляют центрифугированием и прозрачный супернатант наносят на колонку 0,6х12 см, заполненную гидрофобным носителем "Адан" и уравновешенную той же системой, со скоростью 50 мл/ч. После промывки колонки системой нанесения инсулин элюируют 30%-ным водным ацетонитрилом рН 2,2-2,6 со скоростью 30 мл/ч. Элюат лиофильно высушивают. Выход - 25 мг, что составляет 100 мг инсулина на 1 кг поджелудочной железы. Активность - 28,5 МЕ/мг. Чистоту препарата проверяют по электрофорезу в 16% полиакриламидном геле с использованием трицинового буфера, гель окрашивают серебром. П р и м е р 2. Выделение и очистка инсулина свиньи. К 400 мл спиртового экстракта поджелудочной железы свиньи добавляют конц. аммиак до рН 6,0 и далее обрабатывают и наносят на колонку с сульфокатионитом. Диасорб-сульфо, как описано в примере 1. Фракцию инсулина в 0,01 М фосфатном буфере подкисляют 1 М соляной кислотой до рН 2,5-2,8, добавляют ацетонитрил до концентрации 10% и наносят на колонку с "Аданом", уравновешенную 10%-ным водным раствором ацетонитрила рН 2,5-2,8. Обработку колонки и элюцию инсулина ведут так же, как описано в примере 1. К раствору инсулина в 30%-ном водном ацетонитриле добавляют 1 М гидроокись натрия до рН 7,5 и 0,5 мл 1%-ного раствора хлорида цинка. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, растворяют в 20 мл 10% -ного ацетонитрила рН 2,5-2,8 и рехроматографируют на колонке с "Аданом". Выход - 10 мг, что составляет 100 мг на 1 кг поджелудочной железы. П р и м е р 3. Очистка инсулина свиньи. 33 мг инсулина свиньи (Белорусское производственное объединение медицинских препаратов) растворяют в 11 мл 0,01 н. соляной кислоты и наносят на колонку 0,6х17 см, заполненную носителем "Адан" и уравновешенную водой, со скоростью 30 мл/ч. После сорбции колонку промывают водой и инсулин элюируют водным 50%-ным ацетонитрилом. Элюат лиофильно высушивают. Выход - 83%. Активность - 28,5 МЕ/мг.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий обработку спиртового экстракта поджелудочной железы животных при кислом значении pH, отделение осадка, хроматографию надосадочной жидкости на сульфокатионите с последующей элюцией целевого продукта и кристаллизацией его в виде Na- или Zn-солей, отличающийся тем, что перед подкислением подщелачивают, центрифугируют, надосадочную жидкость после подкисления хроматографируют на сульфокатионите на основе силикагеля Диасорб-сульфо, а элюцию проводят натрий-фосфатным буферным раствором pH 7,0 - 8,5, содержащим 0,1 - 1М хлорид натрия, затем снова хроматографируют на гидрофобном носителе "Адан" на основе макропористого стекла в водных или водно-органических системах pH 2,0 - 7,5 с концентрацией органического растворителя от 5 до 30%, а элюцию целевого продукта проводят теми же водноорганическими системами с концентрацией растворителя от 20 до 50%. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на колоке с носителя "Адан" проводят последовательно дважды.

www.findpatent.ru

Типы инсулина и методы его получения - реферат

13

Содержание

  • Введение
  • 1. Типы инсулина
  • 2. Получение инсулина
  • Заключение
  • Список литературы
  • Введение
  • Инсулимн (от лат. insula -- остров) -- гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях.
  • Основная функция инсулина - обеспечивать проницаемость клеточных мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные вещества в конечном счете расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций - митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.
  • Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток -- абсолютная недостаточность инсулина -- является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани -- относительная инсулиновая недостаточность -- имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.
  • История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.
  • В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.
  • После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных сахарным диабетом 1 типа.
  • В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.
  • Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получиь гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.
  • В начале 70-х г.г. советскими учеными А.Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.
  • В дальнейшем шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.
  • В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.
  • Использование аффинной хромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.
  • Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

Таблица 1. Характеристики коммерческих препаратов инсулина

Тип инсулина

Синонимы

Удлинитель

Консервант

Буфер/соли

Bиды

Примеры (торговые названия)

Короткого действия

"Простой", растворимый

Нет

Метилпарабен m-Крезол Фенол

NaCl Глицерин Na(H)PO4 Ацетат Na

Человеч. Свиной Бычий

Актрапид-НМ, Хумулин-Р Актрапид, Актрапид-МС Инсулин для инъекций (СССР, более не производится)

НПХ (NPH)

Изофан

Протамин

m-Крезол Фенол

Глицерин Na(H)PO4

Человеч. Свиной Бычий

Протафан-НМ, Хумулин-Н Протафан-МС Протамин-инсулин (СССР, более не производится)

Ленте

Инсулин-цинк-суспензия (смешанн.)

Цинк

Метилпарабен

NaCl Ацетат Na

Человеч. Свиной Бычий

Монотард-НМ, Хумулин-цинк Монотард-МС, Ленте-МС Ленте

Ультра-ленте

Инсулин-цинк-суспензия (кристалл.)

Цинк

Метилпарабен

NaCl Ацетат Na

Человеч. Бычий

Ультраленте Ультратард

Инсулин короткого действия (ИКД)- регулярный инсулин - представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продолжается 5-7 часов.

Первый инсулин продленного действия (ИПД) был создан в конце 30-х гг., чтобы больные смогли делать инъекции реже, чем это было при использовании только ИКД, - по возможности один раз в сутки. С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере - протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) - НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере - инсулины ультраленте, ленте, семиленте.

Препараты инсулина средней продолжительности действия содержат протамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. после подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.

НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регуляторного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.

В фосфатном буфере все инсулины легко образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить замедленное и стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются быстрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэтому не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названием инсулин-суспензия, инсулин-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.

Инсулин ленте - это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект которого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замедленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и стабильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным терапевтическим средством.

2dip.su

Способ получения инсулина из природного источника и инсулин

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к получению применяемых в терапии сахарного диабета препаратов инсулина. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности для изготовления инсулина. Для получения инсулина используют поджелудочную железу северного оленя, которую гомогенизируют в растворе солянокислого этанола, проводят экстракцию с последующим осветлением раствора и получением супернатанта, который подвергают ионообменной хроматографии и изоэлектрическому осуждению с получением инсулина, очистку которого проводят путем высокоэффективной обратнофазной жидкостной хроматографией. Полученный инсулин способен конкурировать за связь с инсулиновым рецептором в концентрации свыше 100 нг/мл. Технический результат - расширение арсенала природных источников для получения инсулина, способного в дозозависимой манере конкурировать за связь с инсулиновым рецептором, в концентрации свыше 100 нг/мл вызывать резкое увеличение рецепторного связывания, имеющего более высокую, чем у стандартных инсулинов, гидрофобность, а значит, и определенные отличия в структуре его молекулы. 2 с.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к получению применяемых в терапии сахарного диабета препаратов инсулина. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности для изготовления инсулина.

В настоящее время для лечения сахарного диабета используется широкая гамма препаратов инсулина, получаемых из природных источников - островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней. Бычий и свиной инсулины, которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности, проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. Бычий инсулин отличается по аминокислотам в трех положениях, поэтому он обладает высокой иммуногенностью и в настоящее время редко используется. Молекула свиного инсулина, который получают вытяжкой из поджелудочной железы свиньи (Большая медицинская энциклопедия, статья “Инсулин”), отличается от инсулина человека всего лишь на одну аминокислоту в В-цепи (вместо треонина в 30 положении находится аланин) и благодаря современным способам очистки используется достаточно широко. Однако после длительного применения в организме человека начинают накапливаться антитела к свиному инсулину, тем самым сводя на нет его действие. Кроме того, самый быстродействующий инсулин достигает после инъекции своего максимального действия через достаточно большой промежуток времени: от 2 до 8 часов.

Но в связи с ростом заболеваемости сахарным диабетом материального субстрата (поджелудочной железы свиньи) вскоре будет не хватать. Поэтому, несмотря на несомненное качество многокомпонентных свиных инсулинов, которые успешно применяются, в перспективе нужно стремиться переходить на альтернативные источники получения инсулина.

Технический результат настоящего изобретения заключается в расширении арсенала природных источников для получения инсулина, способного в дозозависимой манере конкурировать за связь с инсулиновым рецептором, в концентрации свыше 100 нг/мл вызывать резкое увеличение рецепторного связывания, имеющего более высокую, чем у стандартных инсулинов, гидрофобность, а значит, и определенные отличия в структуре его молекулы.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения инсулина путем выделения его из поджелудочной железы природного источника согласно изобретению используют поджелудочную железу северного оленя, которую гомогенизируют в растворе солянокислого этанола, проводят экстракцию с последующим осветлением раствора и получением супернатанта, который подвергают ионообменной хроматографии и изоэлектрическому осаждению с получением инсулина, очистку которого проводят путем высокоэффективной обратнофазной жидкостной хроматографией.

В дальнейшем предлагаемое изобретение поясняется конкретным примером его выполнения и прилагаемыми чертежами, на которых согласно изобретению:

Фиг.1 - изображает обратнофазную жидкостную хроматографию смеси стандартных инсулинов быка, свиньи и панкреатического инсулина северного оленя;

Фиг.2 - кривые конкурентного вытеснения меченного 125I инсулина поджелудочной железы северного оленя, связанного с гомологичным рецептором плазматических мембран печени крыс.

Предлагаемый способ получения инсулина осуществляют следующим образом.

Поджелудочную железу северного оленя, содержащую наряду с эндокринной тканью большое количество жировых прослоек, гомогенизировали в растворе солянокислого эталона в соотношении 1:15. Экстракцию проводят на шуттельн-аппарате в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего раствор осветляют центрифугированием с получением супернатанта (К-70, 3000 об/мин, 60 мин, 4°С).

Ионообменная хроматография

Супернатант поджелудочной железы подвергают ионообменной хроматографии. Для этого супернатант наносят на колонку (5×50 см), заполненную микропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+ форме. Последующие этапы очистки состоят из обезжиривания белок-катинит 70% этанолом, отмывки от балластных белков (0,5 М раствор уксусного аммония, рН 5,0), элюции инсулина (0,2 N раствор аммонийного буфера, рН 9,4). Контроль состава элюатов осуществляют на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Белковый пик, обнаруживаемый в тех же условиях, что и стандартный инсулин, собирают и после приведения к рН 2,3 проводят его рехроматографию.

Изоэлектрическое осаждение

Сопутствующие основному веществу белки осаждают путем последовательного приведения полученного после ионообменной хроматографии элюата к рН 2,0 и после добавления ацетона (20% от объема раствора) - к рН 4,0. Смеси оставляют на 1 час при +20°С и на ночь при +4°С. Раствор центрифугируют (осадок замораживают). К супернанту добавляют 10%-ный раствор ацетата Zn (2% от объема раствора) и доводят рН до 5,95. Раствор оставляют при +20°С в течение часа, затем помещают на 72 часа в холодильник. Осадок отделяют центрифугированием (К-23, 4000 об/мин или К-70, 3000 об/мин, 60 мин, 4°С).

Высокоэффективная обратнофазная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ВЭЖХ очистку полученного из поджелудочной железы северного оленя инсулина выполняют с применением системы Knauer (Германия) на колонке Диасфер С 18,5 мкм×4,0×250 мм (“ЭЛСИКО”, Россия), с использованием буферных смесей. Скорость элюции - 1 мл/мин. Оптическую плотность элюата регистрируют при 226 нм. Рехроматографию значимых пиков осуществляют в аналогичных фракционированию условиях.

Радиолигандные исследования

Способность выделенного из поджелудочной железы северного оленя инсулина связываться с рецептором инсулина проверяют в специфичной для гормона радиорецепторной системе (Rusakov et al, “Isolation and characterization of insulin in Russian sturgeon (Acipenser guldenstaedti)” J.Peptide Res. 1998. v.51. p.395-400). Она включает меченый инсулин, плазматические мембраны печени и стандартный немеченый гормон. Анализ состоит в построении кривых конкурентного вытеснения свиного 125I инсулина, связанного сплазматическими мембранами, немеченым свиным инсулином, панкреатическим инсулином северного оленя.

Получение меченого гормона

В радиорецепторной тест-системе инсулина используют плазматические мембраны печени крыс, выделенные по методу Невилла (со степенью обогащения мембран рецепторами в 15-20 раз).

Очистку панкреатического инсулина северного оленя (тестируемый препарат) проводят следующим образом. Последовательные процедуры экстракции, ионнообменной хроматографии, изоэлектрического осаждения позволяют получить грубые фракции инсулина, которые после лиофилизации фракционируют с помощью ВЭЖХ. Система буферов дает возможность провести одноэтапное фракционирование панкреатического инсулина.

В одинаковых с тестируемым препаратом условиях были получены “эталонные” хроматограммы смеси коммерческих инсулинов быка (пик №1) и свиньи (пик №2), профили элюции для которых представлены на фиг.1А.

Профиль элюции для панкреатического инсулина северного оленя представлен на фиг.1Б (пик №3).

Хроматограмма тестируемого препарата позволяет проанализировать его физико-химические свойства. Как видно из фиг.1 (Б), разрешающая способность использованной ВЭЖХ системы позволяет проводить разделение инсулина, структура которого отличается двумя аминокислотами, то есть можно говорить о высокой гомогенности полученных пептидов.

Величины “подвижности” (Rf) значимых фракций тестируемого препарата, рассчитанные относительно стандартного инсулина быка и свиньи, приведены в таблице.

Таблица
Подвижность отдельных фракций тестируемых препаратов
 Инсулин северного оленя
 Время удержания на колонке (мин)Rf
Инсулин быка9,281
Инсулин свиньи12,200,76
Пик №110,810,86
Пик №2--
Пик №314,230,65
Пик №419,730,47

Как видно из таблицы, сравнение по времени удержания на колонке подтвердило отсутствие сходства панкреатического инсулина северного оленя как со стандартным инсулином крупного рогатого скота (быка), так и с гормоном свиньи. Инсулин оленя (его мажорная фракция) имеет более высокую, чем у стандартных инсулинов, гидрофобность, а значит, и определенные отличия в структуре его молекулы.

Грубый препарат панкреатичного инсулина северного оленя оценивали в экспериментах in vivo по способности вызывать гипогликемический эффект.

Опытные группы крысят получали внутрибрюшинные инъекции в количестве 50 или 100 мкг инсулина оленя, растворенного в 1,5 мл физиологического раствора. Через 20 мин после введения при дозе 50 мкг у крысят отмечено нарушение координации движения, а при дозе 100 мкг активные судороги, которые снимались введением глюкозы. Судороги крыс в ответ на инъекцию препарата Zn-инсулина северного оленя в экспериментах in vivo и последующее снятие действия препарата внутрибрюшинным введением глюкозы однозначно свидетельствуют об его гипогликемическом эффекте. Подобный метод является стандартным экспресс-тестом, применяемым при определении биологической активности любого инсулина.

Способность отдельных фракций инсулина оленя взаимодействовать с инсулиновым рецептором плазматических мембран печени крыс проиллюстрирована на фиг.2.

Как видно из фиг.2, две фракции инсулина оленя (пик №1-2 и пик №3) способны в дозозависимой манере вытеснять связанный с рецептором меченый гормон. Причем в диапазоне концентраций пептида пика №3 от 0,1 до 100 нг/мл ход кривых вытеснения стандартного инсулина и тестируемой фракции №3 практически не отличается. При концентрации пептидов более 100 нг/мл наблюдалось резкое повышение связывания меченого гормона.

Результаты радиолигандного анализа показали, что отдельные пептиды инсулина северного оленя способны по-разному, но в дозозависимой манере конкурировать за связь с инсулиновым рецептором: в концентрации свыше 100 нг/мл вызывал резкое увеличение рецепторного связывания. Этот факт свидетельствует о наличии во всех исследованных пептидных фракциях фактора, стимулирующего связывание гормона с инсулиновым рецептором.

Ни один из известных к настоящему времени инсулинов позвоночных подобной активирующей способностью не обладает.

Ниже приводятся конкретные примеры выполнения заявленного способа получения инсулина.

Пример 1.

Полупрепаративный способ получения инсулина из поджелудочной железы северного оленя (Rangifer tarandus)

1 этап. Ионообменная хроматография солянокислых экстрактов на катионообменнике КУ-23 в Н'-форме

1.1. Поджелудочная железа. До начала процедур экстрипрированную ткань поджелудочной железы северного оленя (1300 г) сохраняют в замороженном виде

1.2. Гомогенизирование. Раствор солянокислого этанола (96%-ный этанол: дистиллированная вода: 12 N соляная кислота (соотношение 880:220:17). Поджелудочную железу измельчают и гомогенизируют с помощью ножевого гомогенизатора в растворе солянокислого этанола. Соотношение ткань : солянокислый этанол 1:15. Температура 0-4°С.

1.3. Экстракция. Полученный гомогенат встряхивают на шуттель-аппарате в течение 2 ч при температуре 20-25°С.

1.4. Центрифугирование. Полученный экстракт осветляют центрифугированием (4500g 4°C в течение 60 мин.). Центрифуга К-70.

1.5. Хроматография:

Оборудование:

Стеклянная колонка: 5×50 см. Объем смолы 900 см3.

Спектрофотометр СФ-26 (или детектор 280 нм с проточной кюветой).

Реагенты:

Ионообменная смола: Сульфокатионит КУ-23 в Н+-форме.

Буфер А: раствор солянокислого этанола (96%-ный этанол: дистиллированная вода: 12 N соляная кислота (соотношение 880:220:17).

Буфер В: 70%-ный этанол.

Буфер С: 0.5 М раствор уксуснокислого аммония. рН 5.0.

Буфер Д: 0.2 М раствор хлористого аммония. рН 9.4.

Нанесение отмывки элюирование. 19.5 л осветленного центрифугированием экстракта (рН 2.3) наносят на колонку. Скорость нанесения 100 мл/ч/см2. После обезжиривания 70%-ным этанолом (2 л) комплекса белки-катионит проводят элюирование балластных белков 0.5 М раствором уксуснокислого аммония. рН 5.0, объем 15 л. Элюцию инсулина осуществляют с помощью 0.2 М раствора хлористого аммония. рН 9.4 объем 1.0 л. Состав Элюата контролируют спектрофотометрически при 280 нм и приводят к рН к 2.3, после чего проводят его рехматографию (см. п.п.1.1.-1.5.).

2 этап. Изоэлектрическое осаждение, получение комплекса цинк-инсулина северного оленя.

Оборудование: рН-метр.

Центрифуга К-70. К-23.

Реагенты: 10%-ный раствор ацетата Zn.

6 N соляная кислота.

12% раствор аммиака.

Ацетон.

2.1. Освобождение от балластных белков.

Полученный после ионообменной хроматографии элюат, содержащий инсулин, приводят рН к 2.0 (6 N соляная кислота), при помутнении (обычно в течение 30-60 мин) раствор осветляют на сутки при 4°С. Раствор центрифугируют при 3000 g. В течение 30 мин. Центрифуга К-70. Осадок разводят 0.6% уксусной кислотой и лиофилизируют: к надосадку добавляют ацетон (205 объем/объем). Приводят к рН 4.0 раствором 12% аммиака и оставляют на 1-3 суток при 4°С. Инсулинсодержащий раствор центрифугируют при 3000 g. В течение 30 мин. Центрифуга К-70. В дальнейшей работе используют надосадок.

2.2 Получение грубого Zn-инсулина северного оленя. Надосадок быстро доводят рН до 7.0 12% раствором Nh5OH затем ступенчато подкисляют 6 N НСl до рН 5.95. При этом порциями добавляют 10% раствор ацетата цинка Zn(СН3СОО)2 2% от объема надосадка. Активно перемешивая содержимое сосуда стеклянной палочкой в течение 1-1,5 ч при комнатной температуре (20-25°С). Раствор оставляют на 2-ое суток в холодильнике при 4°С, затем центрифугируют (Центрифуга К-23, 4000 g, 60 мин 4°С) и в дальнейшей работе используют осажденный Zn-инсулин.

3 этап. Получение кристаллического препарата инсулина северного оленя.

Оборудование: рН-метр.

Центрифуга К-23.

Реагенты: 0.1 N лимонная кислота

10%-ный раствор ацетата Zn.

6 N соляная кислота.

12% раствор аммиака.

Ацетон

3.1. Кристаллизация инсулина. Осадок Zn-инсулина растворяют в 25 мл 0.1 N лимонной кислоты и 5 мл ацетона 12%-ным раствором аммиака доводят рН до 7.0, затем ступенчато приводят к 5.95 раствором 6 N НСl и добавляя на каждой ступени 5%-ный хлорид цинка (ZnCl2) (общее количество=2% объем/объем). Процесс занимает 1-1.5 ч, в течение которых стеклянной палочкой проводят потирание стенок сосуда. Стимулируя тем самым начальный процесс кристаллизации. Каплю раствора наносят на предметное стекло и под микроскопом контролируют начало образования кристаллов. Затем раствор оставляют на 203 суток в холодильнике при 4°С.

3.2. Осаждение, обезвоживание и сушка препарата инсулина северного оленя.

Взвесь с осадком инсулиновых кристаллов центрифугируют при 3000 g. В течение 30 мин. Надосадок отбрасывают. К осадку приливают 1-2 мл охлажденного ацетона или этанола (-18 -25°С) и переносят в полипропиленовую пробку (энсидорф). Суспензию встряхивают, после чего центрифугируют в течение 2-3 мин при 3000 g. Надосадок удаляют и процедуру обезвоживания препарата повторяют 3-5 раз. Влажный осадок сушат в термостате (или вакуумной камере) при 25-30°С в течение нескольких часов, определяя готовность полученного препарата по мере убывания веса пробирки с кристаллическим инсулином.

4 этап. Анализ биологической активности препарата инсулина северного оленя.

4.1. Биотестирование in vitro. Панкреатический инсулин северного оленя проверяют на способность связываться с рецептором инсулина в специфической для этого гормона радиорецепторной системе, включающей меченный 125I инсулин (160-180 мкКи/мкг). Плазматические мембраны печени (0.4 мг/мл) и стандартный немеченый инсулин свиньи (0.1-10000 кг/мл).

4.2. Биотестирование in vitro. Очищенный препарат панкреатического инсулина северного оленя проверяют на способность вызывать гипогликемический эффект в условиях in vitro. Крысы (массой 60-100 г) получают внутрибрюшинные инъекции 50 или 100 мкг панкреатического инсулина северного оленя. Растворенного в 1.0 мл физиологического раствора. Крысы из контрольной группы получают тот же объем физиологического раствора без панкреатического инсулина северного оленя. Через 20 минут после введения препарата в дозе 50 мкг у крыс отмечают нарушение координации движения, а при дозе 100 мкг - активные судороги, которые снимаются внутрибрюшинным введением раствора глюкозы. Судороги у крыс в ответ на инъекцию препарата Zn-инсулина северного оленя в условиях in vitro и последующее снятие действия препарата после введения глюкозы однозначно свидетельствует о гипогликемическом эффекте панкреатического инсулина северного оленя. Подобный метод является стандартным экспресс-тестом, применяемым при определении биологической активности любого инсулина.

Пример 2.

Аналитико-препаративный способ получения инсулина из поджелудочной железы северного оленя (Rangifer tarandus)

1 этап. Ионообменная хроматография солянокислых экстрактов на катионообменнике КУ-23 в H+-форме

1.1. Поджелудочная железа. До начала процедур экстрипрированную ткань поджелудочной железы северного оленя (1300 г) сохраняют в замороженном виде

1.2. Гомогенизирование. Раствор солянокислого этанола (96%-ный этанол: дистиллированная вода: 12 N соляная кислота (соотношение 880:220:17). Поджелудочную железу измельчают и гомогенизируют с помощью ножевого гомогенизатора в растворе солянокислого этанола. Соотношение ткань:солянокислый этанол 1:15. Температура 0-4°С.

1.3. Экстракция. Полученный гомогенат встряхивают на шуттель-аппарате в течение 2 ч при температуре 20-25°С.

1.4. Центрифугирование. Полученный экстракт осветляют центрифугированием (4000g 4°C в течение 60 мин). Центрифуга К-70.

1.5. Ионнообменная хроматография:

Оборудование:

Стеклянная колонка: 5×50 см. Объем смолы 900 см3.

Спектрофотометр СФ-26.

Реагенты:

Ионообменная смола: Сульфокатионит КУ-23 в Н+-форме.

Буфер А: раствор солянокислого этанола (96%-ный этанол:дистиллированная вода:12 N соляная кислота (соотношение 880:220:17).

Буфер В: 70-%-ный этанол.

Буфер С: 0.5 М раствор уксуснокислого аммония. рН 5.0.

Буфер Д: 0.2 М раствор хлористого аммония. рН 9.4.

Нанесение отмывки элюирование. 19.5 л осветленного центрифугированием экстракта (рН 2.3) наносят на колонку. Скорость нанесения 100 мл/ч/см2. После обезжиривания 70%-ным этанолом (2 л) комплекса белки-катионит проводят элюирование балластных белков 0.5 М раствором уксуснокислого аммония. рН 5.0, объем 15 л. Элюцию инсулина осуществляют с помощью 0.2 М раствора хлористого аммония. рН 9.4 объем 1.0 л. Состав элюата контролируют спектрофотометрически при 280 нм и приводят к рН к 2.3, после чего проводят его рехматографию (см. п.п.1.1.-1.5.).

2 этап. Изоэлектрическое осаждение, получение комплекса цинк-инсулина северного оленя.

Оборудование: рН-метр.

Центрифуга К-23.

Реагенты: 10%-ный раствор ацетата Zn.

6 N соляная кислота.

12% раствор аммиака.

Ацетон.

2.1. Освобождение от балластных белков.

Сопутствующие основному веществу белки осаждают путем последовательного приведения белкового элюата к рН 2.0 (6 N соляная кислота) и после добавления ацетона (20% от объема раствора) к рН 4.0 раствором 12% аммиака. Инсулиносодержащий раствор оставляют на 1 ч при 20°С, затем в течение ночи при 4°С. В случае помутнения или возникновения осадка балластных белков раствор центрифугируют (5000 g. 4°С, в течение 60 мин). Центрифуга К-23.

2.2 Осаждение Zn-инсулина северного оленя. К супернатанту добавляют 10%-ный раствор ацетата цинка (2% от объема раствора) и доводят рН до 5.95. Раствору дают стоять 1 ч при 20°С и в течение 72 ч при 4°С. Осадок Zn-инсулина отделяют центрифугированием (Центрифуга К-23. 4000 g. 60 мин 4°С).

3 этап. Высокоэффективная обратнофазная жидкостная хроматография препарата. Zn-инсулина северного оленя.

Оборудование: Система для высокоэффективной жидкостной хроматографии (Knauer).

Хроматографическая колонка Диасфер-110-С18, 5 мкм. 4.6×250 мм (“ЭЛСИКО”, Россия).

Реагенты: Трифторуксусная кислота.

Ацетонитрил.

Бидистиллированная вода.

3.1. Очистка препарата Zn-инсулина северного оленя. Препарат, полученный из поджелудочной железы северного оленя, очищают методом высокоэффективной обратнофазной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением системы Knauer на колонке Диасорб-110-С18, 5 мкм, 4.6×250 мм (“ЭЛСИКО”, Россия). Элюцию образца проводят со скоростью 1 мл/мин в градиенте буферов А - 0.1% трифторуксусная кислота Н2О, буфер Б - 0.05% Трифторуксусная кислота в 84% ацетонитриле (СН3СN). Оптическую плотность элюата регистрируют при 226 нм. Полученный препарат подвергают повторной очистке с помощью рехроматографии в аналогичных условиях. После проведения очисток содержание инсулина в препарате составляет не менее 97%.

4 этап. Анализ биологической активности препарата инсулина северного оленя.

4.1. Биотестирование in vitro. Панкреатический инсулин северного оленя проверяют на способность связываться с рецептором инсулина в специфической для этого гормона радиорецепторной системе, включающей меченный 125I инсулин (160-180 мкКи/мкг). Плазматические мембраны печени (0.4 мг/мл) и стандартный немеченый инсулин свиньи (0.1-10000 кг/мл).

4.2. Биотестирование in vitro. Очищенный препарат панкреатического инсулина северного оленя проверяют на способность вызывать гипогликемический эффект в условиях in vitro. Крысы (массой 60-100 г) получают внутрибрюшинные инъекции 50 или 100 мкг панкреатического инсулина северного оленя, растворенного в 1.0 мл физиологического раствора. Крысы из контрольной группы получают тот же объем физиологического раствора без панкреатического инсулина северного оленя. Через 20 минут после введения препарата в дозе 50 мкг у крыс отмечают нарушение координации движения, а при дозе 100 мкг - активные судороги, которые снимаются внутрибрюшинным введением раствора глюкозы. Судороги у крыс в ответ на инъекцию препарата Zn-инсулина северного оленя в условиях in vitro и последующее снятие действия препарата после введения глюкозы однозначно свидетельствует о гипогликемическом эффекте панкреатического инсулина северного оленя. Подобный метод является стандартным экспресс-тестом, применяемым при определении биологической активности любого инсулина.

1. Способ получения инсулина, характеризующийся тем, что поджелудочную железу северного оленя гомогенизируют в растворе соляно-кислого этанола в соотношении 1:15, экстрагируют в течение 2 ч при комнатной температуре, осветляют центрифугированием, супернатант подвергают ионообменной хроматографии с использованием микропористым сульфокатионитом К-23 в Н+ форме, проводят изоэлектрическое осаждение путем последовательного приведения полученного после ионообменной хроматографии элюата к рН 2,0 и после добавления ацетона в количестве 20% от объема раствора - к рН 4,0, при этом смеси оставляют на 1 ч при +20°С и на ночь при +4°С, раствор центрифугируют, к супернатанту добавляют 10%-ный раствор ацетата Zn в количестве 2% от объема раствора и доводят рН до 5,95, после чего раствор оставляют при +20°С в течение часа, затем помещают на 72 ч в холодильник и осадок отделяют центрифугированием, получают инсулин, очистку которого проводят путем высокоэффективной обратнофазной жидкостной хроматографии.

2. Инсулин, характеризующийся тем, что он получен по п.1 и способен конкурировать за связь с инсулиновым рецептором в концентрации свыше 100 нг/мл.

www.findpatent.ru

Типы инсулина и методы его получения

3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;

4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

- белок носитель, обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

- аффинный компонент, существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

Химическим способом получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина.

Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.

Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).

В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitroосуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.

Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.

Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Заключение

Сахарный диабет - хроническое заболевание, обусловленное абсолютной или относительной недостаточностью инсулина. Оно характеризующееся глубоким нарушением обмена углеводов с гипергликемией и глюкозурией, а также другими нарушениями обмена веществ в результате воздействия ряда генетических и внешних факторов.

Инсулин до настоящего времени служит радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом. До получения и внедрения инсулина в клинику в 1922-1923 гг. больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход в течение одного-двух лет с начала заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение в силу тех или иных причин регулярного введения инсулина ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.

В настоящее время сахарный диабет по распространенности находится на 3-м месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность сахарного диабета среди взрослого населения в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеется тенденция увеличения количества больных почти в два раза каждые 15 лет. Несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, численность инсулинзависимых больных увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.

Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.

Список литературы

1. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987, стр. 15-25.

2. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 - 23, № 2

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

4. Егоров Н. С., Самуилов В. Д. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.: Высшая школа, 1988. 208 с.

5. Иммобилизация трипсина и карбоксипептидазы В на модифицированных кремнеземах и их применение в превращении рекомбинантного проинсулина человека в инсулин. / Кудрявцева Н.Е., Жигис Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.И., Мальцев К.В., Румш Л.Д. // Хим.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стр. 61 - 64.

6. Молекулярная биология. Структура и функции белков./ Степанов В. М.// Москва, Высшая школа, 1996.

7. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.

8. Синтез фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств. / Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров А.Н. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 12 стр. 953 - 960.

mirznanii.com