Способ получения генно-инженерного инсулина человека. Получение инсулина методом генной инженерии


ПОЛУЧЕНИЕ ИНСУЛИНА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака.

Инсулин — небольшой глобуляр­ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоя­щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.

1- Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника — препроинсулина (106 а/к)

2- При удалении сигналь­ного пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислот­ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при за­мыкании дисульфидных связей.

3- После протеолитического отщеп­ления С-пептида образуется инсулин.(51)

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжелая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибе­лью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удается справляться с помощью соответствующих диет и режи­ма. Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и постав­ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприя­тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 —1000 кг исходного сырья.

В 1980 г. дат­ская компания «Ново индаетри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го ос­татка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не раз­личались по активности и времени действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli

Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагмен­том природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка Р-галактозидазы кишечной палочки Е. сой, в плазмиду Полученная рекомбинантная плазмида рЕк бьша трансформиро­вана в клетки Е. coli. В результате экспрессии встроенного гена бактерия начала продуцировать гибридный (химерный) белок, со­держащий на N-конце участок (З-галактозидазы, а на С-конце — последовательность нейропептида. С помощью бромциана химер­ный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энкефалин. На рис. 1. представлены схема клонирования синтетичес­кого гена лейцин-энкефалина и его экспрессия в клетках кишеч­ной палочки.

Аналогичным путем был синтезирован соматостатин — гор­мон гипоталамуса (рис. 2). Молекула соматостатина состоит из 14 аминокислотных остатков. Соматостатин подавляет выделение инсу­лина и гормона роста человека.

studlib.info

Способ получения генно-инженерного инсулина человека

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета. Способ осуществляют путем культивирования штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушения клеток дезинтеграцией, отделения телец включения, содержащих гибридный белок. Далее проводят предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией. Расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина - кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий последовательность двух синтетических IgG связывающих доменов стафилококкового белка А. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "Integrated production of human insulin and its C-peptide", Journal of biotechnology, 1996, v.48, p.241-250).

Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Coli ДН5а / pVK100, разрушают бактериальные клетки ультразвуковой дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, в течение 12-16 часов. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 37°С в течение 1 часа. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят pH до 4,5 и выдерживают 2 часа при 4°С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при pH 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером pH 10,8 и выдерживают при 4°С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис-HCl буфере, pH 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (соотношение карбоксипептидаза Б:трипсин:гибридный белок 0,3:1:10) при 37°С в течение 30 минут. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонке с DEAE-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис-HCl буфером, pH 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают pH до 2,0 и собирают осадок инсулина.

(Chen J.-Q., Zhang H.-T., Hu М.-Н., Tang J.-G., "Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor" Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p.5-15).

К недостаткам известного способа относится применение гель-фильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большое количество ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией белка линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией (Пат. РФ №2141531, МКИ С12Р 21/02, опубл. 1999 г.)

К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины и органических растворителей на стадии очистки гибридного белка.

Известен способ получения инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 в промышленном ферментере объемом 200-1500 л, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем 8 М мочевину и дитиотреитол в течение 10-12 часов, ренатурацию, разбавление в 5-10-кратном объеме 0,1 М Na-глицинового буфера при pH 9-11 и 10-14°С, очистку ренатурированного гибридного белка после кислотного осаждения и микрофильтрации хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 М трисовым буфером с pH 7,0-7,5, элюированием гибридного белка исходным буфером, содержащим 0,25 М хлористого натрия и 1,5 М мочевины, последовательное расщепление гибридного белка сначала трипсином в соотношении трипсин : гибридный белок 1:(500-100), а затем карбоксипептидазой Б в соотношении фермент : гибридный белок 1:(500-1000), при этом промежуточные продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0, содержащим 3 М мочевину, и элюцией белка линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере. Полученный после гидролиза инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, фракции с чистотой инсулина не менее 98% объединяют, осаждают 10% уксуснокислым цинком при pH раствора 6,3-6,5, осадок центрифугируют, растворяют в 1 М растворе уксусной кислоты и подвергают гель-фильтрации, а целевой продукт кристаллизуют (Пат. РФ №223813 от 18.02.2003, опубл. 20.07.2004).

К недостаткам способа следует отнести многостадийность процесса, связанную с раздельным гидролизом гибридного белка, использование больших количеств трипсина и карбоксипептидазы Б и значительных количеств мочевины и растворителя на стадиях очистки продукта.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА в течение 3-7 часов, очистку регенерированного гибридного белка в одну стадию ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:(1-2):1, очистку инсулина гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка.

(Пат. РФ №2208637, МКИ С12N 15/00, опубл. 2003 г.)

К недостаткам способа следует отнести низкий выход целевого продукта и большую продолжительность процесса.

Изобретение решает задачу повышения выхода инсулина и сокращения длительности процесса.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения генно-инженерного инсулина человека, включающем ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 часов, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.

Техническим результатом изобретения является повышение выхода конечного продукта до 120-180 г фармакопейной субстанции инсулина человека с 1000 л культуральной жидкости по сравнению с 50 г с 1000 л в известном способе и сокращение времени проведения процесса на 24 часа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения генно-инженерного инсулина человека используют штамм-продуцент гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL 21PINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07.

Биосинтез продуцента проводят культивированием.

При культивировании клеток штамма-продуцента гибридного белка для получения инокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 20 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 1000 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:

1. Тельца включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трисом при pH 9,0.

2. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5-10 мМ дитиотреитола (ДТТ), при pH 8,0. Осадок отделяют центрифугированием.

3. Ренатурацию проводят следующим образом: супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ трисовым буфером с pH 9,5 при 6-9°С так, чтобы концентрация общего белка составила 0,7-0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 48 часов.

4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на DEAE-сефарозе.

5. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора до pH 3,0, прибавляют хлористый натрий, центрифугируют. Осадок инсулина передают на стадию очистки.

6. Очистка инсулина может выполняться двумя альтернативными способами:

а) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М, повышают pH до 6,6 и раствор наносят на колонку, упакованную гидрофобным сорбентом. Сорбированный материал элюируют этанолом в цитратном буфере в градиентном режиме. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку.

б) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте и наносят на препаративную колонну ОФ ВЭЖХ. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на дальнейшую очистку.

7. Готовят раствор инсулина в 0,5 М уксусной кислоте и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке с сефадексом G-50 SF SG.

8. Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2 М, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на центрифугах при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трис-буфере при температуре 6°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трис-буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,7 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну BPG 450 с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия при концентрации NaCl от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 98 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при массовом соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 6°С. Время проведения процесса 20 часов. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин осаждают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М, осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют посредством гидрофобной хроматографии низкого давления. Инсулин в количестве 120 г растворяют в 15 л раствора 10 мМ лимонной кислоты, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М и доводят pH до 6,6. Подготовленный таким образом раствор инсулина наносят на колонну с 30 л сорбента Butyl Toyopearl 650S, предварительно уравновешенную цитратным буфером с 0,5 М хлорида натрия, pH 6,6. Инсулин десорбируют этиловым спиртом в цитратном буфере (концентрация спирта от 10 до 23%). Фракции с чистотой инсулина 98% и выше объединяют и передают на следующую стадию. Материал с чистотой менее 98% возвращают на повторную очистку.

65 г очищенного инсулина осаждают 3 М хлоридом натрия, осадок центрифугируют и передают на стадию гель-фильтрации. Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции выделяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в выделенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, кристаллизуют в присутствии солей цинка с последующей сушкой под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м3 культуральной жидкости) составляет 120 г.

Пример 2.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli BL 21/pPINS07(BL07) проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2М, и разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на проточной центрифуге при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трисовом буфере при температуре 9°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трисовый буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,8 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия с концентрацией от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 100 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 9°С. Время проведения процесса 22 часа. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин высаживают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М. Через 20 часов осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют методом препаративной ОФ ВЭЖХ. Для очистки используют сорбент на силикагелевой основе с привитой фазой С8, размер частиц сорбента 15 мкм.

На колонну наносят 35 г инсулина, растворенного в 10 мМ лимонной кислоте. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония pH 3,0. Чистоту фракций контролируют ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на стадию гель-фильтрации.

Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в объединенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин осаждают ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина (после 2 циклов гель-фильтрации) составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м3 культуральной жидкости) составляет 180 г.

Способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 ч, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.

www.findpatent.ru

Получение инсулина.

Производство Получение инсулина.

просмотров - 145

Возможности генной инженерии.

Сегодня в мире, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), насчитывается около 110 млн людей, страдающих диабетом. И эта цифра в ближайшие 25 лет может удвоиться. Диабет- страшное заболевание, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ вызывается нарушением работы поджелудочной желœезы, вырабатывающей гормон инсулин, необходимый для нормальной утилизации содержащейся в пище углеводов. На начальных этапах развития болезни достаточно использовать меры профилактики, регулярно следить за уровнем сахара в крови, потреблять меньше сладкого. При этом для 10 млн пациентов показана инсулиновая терапия; они вводят в кровь препараты этого гормона. Начиная с двадцатых годов прошлого века для этих целœей использовали инсулин, выделœенный из поджелудочной желœезы свиньи и телят. Инсулин животных аналогичен человеческому, разница состоит по сути в том, что в молекуле инсулина свиньи в отличие от человеческого в одной из цепей аминокислота треонин замещена аланином. Считается, что эти незначительные отличия могут вызвать у пациентов серьезные нарушения в работе почек, расстройстве зрения, аллергию). Вместе с тем, несмотря на высокую степень очистки, не исключена вероятность переноса вирусов от животных к людям. И, наконец, число больных диабетом растет так быстро, что обеспечить всœех нуждающихся животным инсулином уже не представляется возможным. И это весьма дорогое лекарство.

Инсулин был впервые выделœен из поджелудочной желœезы быка в 1921 ᴦ. Ф Бантингом и Ч. Бестом. Он сотсоит их двух полипептидных цепей, соединœенных двумя дисульфидными связями. Полипептидная цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь В- 30 аминокислотных остатков, молекулярная масса инсулина 5, 7 кDа. Ниже представлена аминокислотная последовательность инсулина человека:

Гли-Иле-Вал-Глу-Гли-Цис-Тре-Сер-Иле-Цис-С-Лей-Тир-Гли-Лей-Гли-Лей-Глу-Асн-

Фен-Вал-Асн-Гли-Гис-Лей-Цис-Глу-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Глу-Глу-

Фен-Вал-Асн-Гли-Гис-Гис-Лей-Цис-Глу-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Глу-Глу

Трп-Лис-Про-Трп-Тир-Фен-Фен-Глу-Арк

Структура инсулина достаточно консервативна. Аминокислотная последовательность инсулина человека и многих животных различается всœего на 1-2 аминокислоты. У рыб по сравнению с животными В- цепь больше и содержит 32 аминокислотных остатка..

Стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной желœезы, а одна желœеза коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

Генетическая инженерия, родившись в начале 70-х годов, добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средсв. Сегодня кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.

В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединœении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделœения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной желœезы свиньи или коровы.

У животных и человека инсулин синтезируется в β- клетках островков Ларгенганса. Гены, кодирующие данный белок у человека, локализованы в коротком плече 11-ой хромосомы. Зрелая инсулиновая мРНК состоит из 330 нуклеотидов, что соответствует 110 аминокислотным остаткам. Именно такое их количество содержит предшественник инсулина – препроинсулин. Он состоит из одной полипептидной цепи, на N- конце которой находится сигнальный пептид (24 аминокислоты), а между А- и В- цепями локализован С- пептид, содержащий 35 аминокислотных остатков.

Процесс созревания инсулина начинается в цисцернах эндоплазматического ретикулума, где под действием фермента сигналазы с N- конца отщепляется сигнальный пептид. Далее в аппарате Гольджи под действием эндопептидаз вырезается С-пептид и образуется зрелый инсулин. На транс- стороне аппарата Гольджи новосинтезированный гормон соединяется с цинком, образуя надмолекулярные структуры (три-, тетра,- пента- и гексамеры), перемещающиеся затем в секреторные гранулы.

Последние отделяются от аппарата Гольджи, перемещаются к цитоплазатической мемебране, ассоциируются с ней, и инсулин секретируется в кровяное русло. Скорость секреции гормона определяется концентрацией глюкозы и ионов Са2+ в крови. Адреналин подавляет освобождение инсулина, а такие гормоны, как ТТГ и АКТГ, напротив, способствуют его секреции. В крови инсулин находится в двух формах: свободной и связанной с белками, преимущественно с транферрином и α2- глобулином. Время «полужизни» инсулина составляет около пяти минут, причем распад начинается в крови, т.к. в эритроцитах имеются инсулиновые рецепторы и довольно активная инсулин- деградирующая система. Инсулиназа эритроцитов является Са- зависимой, тиоловой протеиназой, функционирующей совместно с глутатион- инсулин-ирансгидрогеназой, расщепляющей дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями инсулина.

Фрагментация инсулина и его распад происходят преимущественно в печени, почках и плаценте.

Фрагменты инсулина обладают биологической активностью и принимают участие в ряде метаболических процессов. Одной из осœеовных функций инсулина является регуляйия транспорта глюкозы, аминокислот, ионов и др. метаболитов в клетки печени, почек, жировой ткани др. органов. Механизм действия этого гормона отличается от такового для др. пептидных гормонов и является уникальным в регуляции метаболических процессов. Инсулиновый рецептор представляет собой тетрамер, состоящий из двух α- и двух β-субъединиц, одна из которых обладает тироксиназной активностью. Инсулин при взаимодействии с α-субъединицами, расположенными на поверхности цитоплазматической мембраны, образует гормон- рецепторный комплекс. Конформационные изменения тетрамера приводят к активации трансмембранной β-субъединицы рецептора, обладающей тирозинкиназной активностью. Активная тирозинкиназа способна к фосфорилированию мембранных белков.Образуются мембранные каналы, через которые глюкоза и др. метаболиты проникают в клетки. Свободный инсулин под действием тканевой инсулиназы распадается на семь фракций, пять из которых обладают биологической активностью.

Вместе с тем, инсулин стимулирует ряд биосинтетических процессов: синтез нуклеотидов, нуклеиновых кислот, ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, гликогена. В жировой ткани инсулин активирует процесс образования ацетил Ко А и жирных кислот. Он является одним из индукторов синтеза холестерина, глицерина и глицераткиназы.

Мутации в структуре инсулинового гена, нарушение механизмов посттранскрипционного и посттрансляционного процессинга приводят к образованию дефектных молекул инсулина и, как следствие, к нарушению обменных процессов, регулируемых данным гормоном. В результате развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет.

Разработка технологии производства искусственного инсулина является поистинœе триумфом генетиков. Сначала с помощью специальных методов определили строение молекулы этого гормона, состав и последовательнгсть аминокислот в ней. В 1963 ᴦ. молекулу инсулина синтезировали с помощью биохимических методов. При этом осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, включающий 170 химических реакций, оказалось сложно.

По этой причине в дальнейших исследованиях упор был сделан на разработку технологии биологического синтеза гормона в клетках микроорганизмов, для чего использовали весь арсенал методов генетической инженерии. Зная последовательность аминокислот в молекуле инсулина, ученые рассчитали, какой должна быть последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем данный белок, чтобы получить нужную последовательность аминокислот. «Собрали» молекулу ДНК из отдельных нуклеотидов в соответствии с определœенной последовательностью, «добавили» к ней регуляторные элементы, нкеобходимые для экспрессии гена в прокариотическом организме Е.coli, и встроили эту конструкцию в генетический материал микроба. В результате бактерия смогла вырабатывать две цепи молекулы инсулина, которые в дальнейшем можно было соединить с помощью химической реакции и получить полную молекулу инсулина.

Наконец, ученым удалось осуществить в клетках Е.coli биосинтез молекулы проинсулина, а не только ее отдельных цепей . Молекула проинсулина после биосинтеза способна соответствующим образом преобразовываться (формируются дисульфидные связи между цепями А и В), превращаясь в молекулу инсулина. Эта технология имеет серьезные преимущества, поскольку различные этапы экстракции и выделœения гормона сведены до минимума. При разработке такой технологии была выделœена информационная РНК проинсулина. Используя ее в качестве матрицы, с помощью фермента обратной транскриптазы синтезировали комплементарную ей молекулу ДНК, которая представляла собой практически точную копию натурального гена инсулина. После пришивания к гену необходимых регуляторных элементов и переноса конструкции в генетический материал Е.coli

Стало возможным производить инсулин на микробиологической фабрике в неограниченных количествах. Его испытания показали практически полную идентичность натуральному инсулину человека. Он намного дешевле препаратов животного инсулина, не вызывает осложнений.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. В случае если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (к примеру, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. В случае если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

В случае если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, бывают получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. К примеру, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.

Сейчас даже трудно предсказать всœе возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Лекция 5. Комплексная переработка биологического сырья

Под комплексной переработкой биологического сырья понимают совокупность технологических процессов (технологий), направленных на получение продуктов различной природы из одного источника. Таким источником может являться биомасса промышленных микроорганизмов, водоросли, растительные и животных клетки и отходы сельскохозяйственной промышленности.

При этом важно, чтобы себестоимость всœех продуктов комплексной переработки сырья была ниже суммы себестоимостей каждого вида товарного продукта͵ полученного в производстве с учетом затрат на природоохранные мероприятия. Особенное значение это имеет при переработке биологического сырья, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ включает природные биополимеры белковой, углеводной , липидной и нуклеотидной природы. Клетки, содержащие их в значительных количествах, представляют интерес для комплексной переработки, поскольку позволяют выделять из них ценные продукты, прежде всœего пищевого и медицинского назначения.

Различия в физико-химических свойствах природных биополимеров предопределяют выбор технологических приемов их выделœения и очистки. К примеру, глубина комплексной переработки микробиологического сырья может быть различной. Применяемые в ней технологии должны быть гибкими, а объем выпускаемой продукции должен отвечать потребностям рынка. При переработке микробной массы с целью получения продуктов липидной природы используют бактерии, дрожжи, микроскопические грибы и водоросли. Продукты полинуклеотидной и белковой природы получают из биомассы бактерий и дрожжей.

В биотехнологическом производстве продуктов основой является оборудование и особенно, связанное со стадией ферментации, так как определяет состав и свойства биопродуктов и культуральной жидкости. Вместе с тем, в большинстве случаев именно на стадии ферментации закладываются основные экономические показатели биотехнологического производства и конкурентноспособность получаемых биопродуктов.

Существуют различные биотехнологические способы интенсификации ферментации: использование более активного штамма- продуцента͵ аппаратурное усовершенствование, оптимизация состава питательной среды и условий культивирования, применение биостимуляторов, эмульгаторов и т.д. Все они способны обеспечить максимальную продуктивность биотехнологического процесса и повысить выход конечного продукта.

В то же время наиболее существенное влияние на характер протекания процесса ферментации и его конечные технологические показатели оказывает аппаратура. Рассматривая многообразие ферментационных аппаратов, применяемых в настоящее время в биохимических производствах, можно сделать вывод, что во всœех реакторах происходят определœенные физические процессы (гидродинамические, тепловые и массообменные), с помощью которых создаются оптимальные условия для проведения собственно биохимического превращения вещества (биохимической реакции).

Для осуществления этих физических процессов биохимический реактор снабжается типовыми конструктивными элементами, широко применяемыми также в химических аппаратах для проведения собственно физических процессов (мешалки, контактные устройства, теплообменники, диспергаторы и т.д.). Ферментер любой конструкции должен удовлетворять основным требованиям процесса культивирования клеток: обеспечить подвод к каждой клетке питательных веществ, отвод продуктов метаболизма, обеспечить поддержание оптимальных рабочих параметров, требуемый уровень аэрирования, перемешивания, высокий уровень автоматизации и т.д.

Значение биохимии в биотехнологии

Фундаментальная биохимия является основой для многих наук биологического профиля, таких, как генетика, физиология, иммунология, микробиология. Успехи клеточной и генной инженерии в последние годы в значительной мере сблизили биохимию с зоологией и ботаникой. Велико значение биохимии для таких наук, как фармакология и фармация. Биологическая химия изучает различные структуры на клеточном и организменном уровнях. Основой жизни является совокупность химических реакций, обеспечивающих обмен веществ. Таким образом биохимию можно считать основным языком всœех биологических наук. Сегодня как биологические структуры, так и обменные процессы, благодаря применению эффективных методов, изучены достаточно хорошо. Многие разделы биохимии в последние годы развивались столь интенсивно, что выросли в самостоятельные научные направления и дисциплины. Прежде всœего можно отметить биотехнологию, генную инженерию, биохимическую генетику, экологическую биохимию, квантовую и космическую биохимию и т.д. Велика роль биохимии в понимании сути патологических процессов и молекулярных механизмов действия лекарственных веществ.

Все живые организмы состоят из клеток и продуктов их метаболизма. Это в 1838 году доказали М.Шлейден и Т.Шванн, которые постулировали, что растительные и животные организмы построены из клеток, расположенных в определœенном порядке. Спустя 20 лет Р.Вирхов сформулировал основы клеточной теории, указав, что всœе живые клетки возникают из предшествующих живых клеток. В дальнейшем клеточная теория развивалась и дополнялась по мере совершенствования методов познания. Каждая клетка является обособленной функциональной единицей, имеющей ряд специфических особенностей, в зависимости от ее природы. Микроорганизмы представлены отдельными клетками или их колониями, а многоклеточные организмы, к примеру животные или высшие растения, состоят из миллиардов клеток, соединœенных друг с другом. Клетка представляет собой своеобразную фабрику, на которой реализуются многообразные и согласованные химические процессы, как и на реальной фабрике, в клетке имеется центр управления, участки контроля за теми или иными реакциями, регуляторные механизмы. В клетку также поступает сырье, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ перерабатывается в готовую продукцию, и отходы, которые выбрасываются из клетки.

Клетки постоянно синтезируют вещества, необходимые для их жизнедеятельности. Эти вещества находят всœе большее применение в промышленности и медицинœе. Некоторые из них уникальны и не бывают получены методом химического синтеза.

Читайте также

  • - Получение инсулина.

    Возможности генной инженерии. В настоящее время в мире, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), насчитывается около 110 млн людей, страдающих диабетом. И эта цифра в ближайшие 25 лет может удвоиться. Диабет- страшное заболевание, которое вызывается... [читать подробенее]

  • oplib.ru

    Получение инсулина,методами генной инженерии, Биология

    Пример готовой курсовой работы по предмету: Биология

    Содержание

    Содержание

    Введение 3

    Глава

    1. Строение и функции инсулина 5

    1.1. Строение молекулы инсулина 5

    1.2. Биологическое значение инсулина 7

    1.3. Биосинтез инсулина 8

    Глава

    2. Синтез инсулина методами генной инженерии 10

    2.1. Применение методов генной инженерии для синтеза лекарственных препаратов 10

    2.2. Методы генной инженерии 11

    2.3. Получение инсулина методами генной инженерии 14

    Заключение 18

    Литература 20

    Приложение 22

    Выдержка из текста

    Введение

    Инсулин — белковый гормон, вырабатываемый β-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Гормон оказывает влияние преимущественно на углеводный обмен, обеспечивает проницаемость клеточной мембраны для молекул глюкозы. В отсутствие инсулина проницаемость клеточных мембран для глюкозы снижается в 20 раз, в крови образуется избыток сахара, оказывающий негативное влияние на организм [1].

    Ключевым звеном патогенеза сахарного диабета первого типа является абсолютная недостаточность инсулина, возникающая в результате нарушения секреции инсулина при разрушении β-клетками.

    Инсулин был первым белком, аминокислотная последовательность которого была расшифрована полностью.

    В 1978 году инсулин был впервые синтезирован в генетически модифицированной бактерии. Синтез инсулина стал началом новой эпохи в биотехнологии: в 1982 году американская компания Genentech стала продавать натуральный человеческий инсулин, синтезированный в биореакторе генно-модифицированными бактериями E.coli. Развитие методов очистки гормона от примесей и продуктов деградации инсулина позволило получить однокомпонентный гомогенный инсулин [6, 11].

    Разработка новых технологий синтеза инсулина направлена на улучшение его степени очистки, что позволяет уменьшить инсулиновую аллергию и иммунную резистентность к инсулину. Возникла необходимость получения более эффективных гормонов для заместительной терапии при сахарном диабете — гомологичного инсулина, то есть инсулина человека.

    В 80-е годы достижения молекулярной биологии позволили синтезировать обе цепи человеческого инсулина с помощью E.coli. В Институте биоорганической химии РАН с использованием генно-инженерных штаммов E. coli получен рекомбинантный инсулин [10].

    Использование аффинной хромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой молекулярной массой, чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, способные индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

    С самого начала терапии использование человеческого инсулина сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин абсорбируется быстрее, абсорбция не зависит от формы препарата. Человеческий инсулин обладает меньшей иммуногенностью, чем свиной, и особенно смешанный бычий и свиной инсулин.

    Цель работы: изучение синтеза инсулина методом генной инженерии

    Задачи исследования:

    • познакомиться с различными типами инсулина и их ролью в организме

    • изучить методы генной инженерии

    • ознакомиться с методами синтеза инсулина

    Объект исследования: инсулин

    Предмет исследования: синтез инсулина методами генной инженерии

    Список использованной литературы

    Литература

    1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.

    2. Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.

    3. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2

    4. Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517−532. — 589 с.

    5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

    6. Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.

    7. Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.

    8. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.

    9. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.

    10. Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.]

    // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23

    11. Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.

    12. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.

    13. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.

    14. www.biotechnolog.ru/ge/ge 31.htm

    15. microbiologu.ru

    16. www.mikrobiki.ru

    17. www. gmo-compass.org

    referatbooks.ru