Получение инсулина. Получение инсулина


Получение инсулина.

 

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака. Инсулин - небольшой глобуляр­ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоя­щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника - препроинсулина, содержащего кон­цевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигналь­ного пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислот­ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую пространственную ориентацию при за­мыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщеп­ления С-пептида образуется инсулин.

Со времени открытия инсулина в 1921 году Бантингом и Бестом, которые выделили гормон из поджелудочной железы новорожденного теленка и показали снижение уровня глюкозы в сыворотке крови экспериментального животного после введения препарата, прошло больше 80 лет. За это время была создана индустрия производства инсулина.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и постав­ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприя­тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 -1000 кг исходного сырья. Однако такой инсулин отличается по строению (аминокислотной последовательности) от инсулина человека и его использование напрямую малоэффективно. Например свиной инсулин отличается от человеческого на одну аминокислоту у С-конца В-цепи (аланин вместо треонина- на) Поэтому предварительно проводят химическую модификацию животного инсулина с целью придания ему структуры человеческого инсулина. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствуещего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

Развитие с середины 1970-х годов технологии получения рекомбинантных ДНК значительно изменило характер исследований, проводимых в области генетики, молекулярной биологии и биотехнологии. Разработка методов изменения генетического аппарата клеток, позволяющих вводить в них чужеродные гены, клонировать их, экспрессировать и получать биосинтетические белки в необходимом количестве обеспечила возможность создания новой отрасли фармацевтической промышленности и обеспечения здравоохранения различными белковыми препаратами (инсулином, эритропоэтином, интерферонами и др.)

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli. Каждый из полученных синтетических генов последовательно подстраивался к 3 '-концу гена фермента (β-галактозидазы и вводил­ся в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформиро­ванные такими рекомбинантными плазмидами, производили гиб­ридные (химерные, рекомбинантные) белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы, соединенной через остаток метионина с А и В цепями инсулина. При обработке in vitro химерного белка бромцианом пептид А-В высвобождался и далее ферментативно расщеплялся на фрагменты А и В. Однако замыкание дисульфидных мостиков между несвязанными С-пептидом А и В-звеньями инсулина происходило с трудом и данный метод получения инсулина не получил своего развития .

Поэтому в дальнейшем был разработан метод получения проинсулина человека целиком, с последующей его трансформацией в инсулин in vitro. Для этого искусственно была синтезирована нуклеотидная последовательность кодирующая структуру проинсулина, которая затем была встроена в плазмиду к 3 '-концу гена β-галактозидазы. Трансформированные такими плазмидами клетки Е. coli синтезировали химерный белок, состоящий из фрагментов проинсулина и β-галактозидазы, который далее in vitro последовательно превращали в инсулин человека (рис.1.).

 

 

 

Похожие статьи:

poznayka.org

Инсулин. Часть II. Микробиологическое получение инсулина

Инсулин Часть II. Микробиологическое получение инсулина.

В предыдущей статье были рассмотрены биологические и физико-химические свойства инсулина, а также его биосинтез в организме человека. Как уже говорилось выше, на данный момент существует потребность в производстве этого гормона в достаточных количествах. В данной статье мы рассмотрим методы получения инсулина человека по мере их разработки (в хронологическом порядке).

1. Способы получения инсулина человека.

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического.

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида - дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами [2]: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом [1] и генно-инженерным способом [3]. В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека [1].

Как уже упоминалось выше (см. статью "Инсулин", Часть I.), инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В [4, 5] до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

аффинный компонент - существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

2 Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli..

В работе [6] авторы использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину. Другая группа исследователей [3] получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой [7] из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. В работе [8] сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так в работе [9] авторы получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей [10] действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так в работе [11] описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида- носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

В работе [12] описано получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе. 3 Очистка инсулина.

Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13]. Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе [6] авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы [15] разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина. В работе [16] сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика [17] определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе [18] исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд.

В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина [19], структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 - 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. В работе [20] сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения , представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе [21] лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.

Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, авторы работы [22] трансфицировали кДНК белка-переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins. В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа "искусственной b-клетки", полученной методами генной инженерии.

Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств [23, 24]. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида показано наличие биологической активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях наряду с инсулином. В следующих статьях этой серии будут рассмотрены физико-химические и биологические свойства С-пептида, а также методы его получения.

Автор статьи: Воюшин К. Е.

Список цитируемой литературы:

1. Молекулярная биология. Структура и функции белков./ Степанов В. М.// Москва, Высшая школа, 1996.

2. Биоорганическая химия./ Овчинников Ю. А.// Москва, Просвещение, 1987.

3. Протеолиз проинсулина человека, катализируемый нативным, модифицированным и иммобилизованным трипсином. / Миргородская О.А., Казанина Г.А., Миргородская Е.П., Шевченко А.А., Мальцев К.В., Мирошников А.И., Ройпсторфф П. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 2 стр. 91 - 97.

4. Иммобилизация трипсина и карбоксипептидазы В на модифицированных кремнеземах и их применение в превращении рекомбинантного проинсулина человека в инсулин. / Кудрявцева Н.Е., Жигис Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.И., Мальцев К.В., Румш Л.Д. // Хим.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стр. 61 - 64.

5. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства./ Клюшниченко В. Е., Акимов С. А., Мальцев К. В., Арутюнян А. М., Иванов А. Е., Вульфсон А. Н.// Биорганическая химия, 1992 - 18, № 12 стр. 1478-1486.

6. Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin. / Cowley D. J., Mackin R. B. // FEBS Lett., 1997 - 402, № 2-3 стр. 124 - 130.

7. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / Ford C.F., Suominen I., Glatz C.E. // Protein Expr. Purif., 1991 - 2, № 2-3, стp. 95-107.

8. Generation of human insulin: Заявка WO 96/20724 междунар. РСТ, МКИ6 A61K 38/28, C12N 15/17 / Hartman J., Mendelovitz S., Goresku M., Bio-Technology General Corp. - № 94/13268; Заявл 29.12.94; Опубл 11.7.96.

9. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. / Castellanos-Serra L.R., Hardy E., Ubieta R., Vispo N.S., Fernandez C., Besada V., Falcon V., Gonzalez M., Santos A., Perez G., Silva A., Herrera L. // FEBS Lett., 1996 - 378, № 2 стр. 171 - 176.

10. Integrated production of human insulin and its C-peptide. / Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. // J. Biotechnol., 1996 - 48, № 3 стр. 241 - 250.

11. Gene fragment polimerization gives increased yields of recombinant human proinsulin C-peptide. / Jonasson P., Nygren P.A., Johansson B.L., Wahren J., Uhlen M., Stahl S. // Gene, 1998 - 210, № 2 стр. 203 - 210.

12. Preparation of Tyr-C-peptide from genetically altered human insulin precurssor. / Sun H., Tang J., Hu M. // Appl. Biochem. Biotechnol., 1995 - 55, № 3 стр. 167 - 174.

13. Coordinative interactions in the separetion of insulin and its derivatives by high-performans liquid chromatography./ Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K.// J. Chromatogr., 1987 - 408 стр. 43-52.

14. Высокоэффективная жидкостная хроматография флюоресцентных производных инсулина. / Петроченко Е.В., Кисилев П.А. // Биоорганическая Химия, 1996 - 22, № 3 стр. 175 - 179.

15. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 - 23, № 2 стр 98 - 103.

16. Determination of insulin and other secretory products from islet of langerhans using liquid cromatography coupled with electrochemical detection. / Shen H., Huang L., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'95, New Orleans, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. - [New Orleans, (La)], 1995 стр. 481.

17. Dual microcolumn immunoaffinity liquid chromatography of insulin. / Shen H., Aspinwall C. A., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'96, Chicago, III, March 3-8, 1996: Book Abstr. - [Chicago, (III)], 1996 стр. 867.

18. Competitive immunoassay for insulin using capillary electrophoresis. / Tao L., Shultz N. M., Kennedy R. T. // Pittsburgh Conf. [Anal. Chem. and Apll. Spectrosc.] presents PITTCON'95, New Orleans, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. - [New Orleans, (La)], 1995 стр. 10.

19. Hepatospecific insulin analoques. : Пат 5208217 США, МКИ5 А61К 37/26, С07К 7/40 / Katsoyannis P.G., Mount Sinai School of Medicine of the city University of New York - № 785146; Заявл. 29.10.91; Опубл. 04.05.93; НКИ 514/3.

20. Макромолекулярные системы с инсулином в связи с проблемой диабета. / Плате Н.А., Валуев Л.И., Старосельцева Л.К., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Валуев И.Л., Сытов Т.А., Аметов А.С., Княжев В.А. // Высокомолек. соед. А - Б, 1994 - 36, № 11 стр. 1876 - 1879.

21. Способ получения препарата инсулина для перрорального применения : Пат 2058788 Россия, МКИ6 А61К 38/28, 9/14 Моренкова С. А. - № 5000106/14 Заявл. 26.7.91; Опубл. 27.4.96, Бюл. № 12.

22. Gen therapy of diabetes: Glucose-stimulated insulin secretion in a human hepatoma cell line (HEP G2 Inslg). / Simpson A. M., Marshall G. M., Tuch B. E., Maxwell L., Szymanska B., Tu J., Beynon S., Swan M. A., Comacho M. // Gene Ther., 1997 - 4, № 11 стр. 1202 - 1215.

23. Синтез фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств. / Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров А.Н. // Биоорганическая Химия, 1997 - 23, № 12 стр. 953 - 960.

24. Аналоги проинсулина человека. Получение делеции в участке гена проинсулина, кодирующего область связывания с рецептором. / Гурьев С.О., Тялина Ю.Ю., Траханова М.Н., Яроцкий С.В. // Антибиотики и Химиотерапия, 1994 - 39, № 4 стр 3 -7.

www.rusbiotech.ru

Получение инсулина

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

В настоящее время в мире, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), насчитывается около 110 млн людей, страдающих диабетом. И эта цифра в ближайшие 25 лет может удвоиться. Диабет- страшное заболевание, которое вызывается нарушением работы поджелудочной железы, вырабатывающей гормон инсулин, необходимый для нормальной утилизации содержащейся в пище углеводов. На начальных этапах развития болезни достаточно использовать меры профилактики, регулярно следить за уровнем сахара в крови, потреблять меньше сладкого. Однако для 10 млн пациентов показана инсулиновая терапия; они вводят в кровь препараты этого гормона. Начиная с двадцатых годов прошлого века для этих целей использовали инсулин, выделенный из поджелудочной железы свиньи и телят. Инсулин животных аналогичен человеческому, разница заключается в том, что в молекуле инсулина свиньи в отличие от человеческого в одной из цепей аминокислота треонин замещена аланином. Считается, что эти незначительные отличия могут вызвать у пациентов серьезные нарушения в работе почек, расстройстве зрения, аллергию). Кроме того, несмотря на высокую степень очистки, не исключена вероятность переноса вирусов от животных к людям. И, наконец, число больных диабетом растет так быстро, что обеспечить всех нуждающихся животным инсулином уже не представляется возможным. И это весьма дорогое лекарство.

Инсулин был впервые выделен из поджелудочной железы быка в 1921 г. Ф Бантингом и Ч. Бестом. Он сотсоит их двух полипептидных цепей, соединенных двумя дисульфидными связями. Полипептидная цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь В- 30 аминокислотных остатков, молекулярная масса инсулина 5, 7 кDа.

Структура инсулина достаточно консервативна. Аминокислотная последовательность инсулина человека и многих животных различается всего на 1-2 аминокислоты. У рыб по сравнению с животными В- цепь больше и содержит 32 аминокислотных остатка.

Стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

Генетическая инженерия, родившись в начале 70-х годов, добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средсв. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.

В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

У животных и человека инсулин синтезируется в β- клетках островков Ларгенганса. Гены, кодирующие этот белок у человека, локализованы в коротком плече 11-ой хромосомы. Зрелая инсулиновая мРНК состоит из 330 нуклеотидов, что соответствует 110 аминокислотным остаткам. Именно такое их количество содержит предшественник инсулина – препроинсулин. Он состоит из одной полипептидной цепи, на N- конце которой находится сигнальный пептид (24 аминокислоты), а между А- и В- цепями локализован С- пептид, содержащий 35 аминокислотных остатков.

Процесс созревания инсулина начинается в цисцернах эндоплазматического ретикулума, где под действием фермента сигналазы с N- конца отщепляется сигнальный пептид. Далее в аппарате Гольджи под действием эндопептидаз вырезается С-пептид и образуется зрелый инсулин. На транс- стороне аппарата Гольджи новосинтезированный гормон соединяется с цинком, образуя надмолекулярные структуры (три-, тетра, — пента- и гексамеры), перемещающиеся затем в секреторные гранулы.

Последние отделяются от аппарата Гольджи, перемещаются к цитоплазатической мемебране, ассоциируются с ней, и инсулин секретируется в кровяное русло. Скорость секреции гормона определяется концентрацией глюкозы и ионов Са2+ в крови. Адреналин подавляет освобождение инсулина, а такие гормоны, как ТТГ и АКТГ, напротив, способствуют его секреции. В крови инсулин находится в двух формах: свободной и связанной с белками, преимущественно с транферрином и α2- глобулином. Время «полужизни» инсулина составляет около пяти минут, причем распад начинается в крови, т.к. в эритроцитах имеются инсулиновые рецепторы и довольно активная инсулин- деградирующая система. Инсулиназа эритроцитов является Са- зависимой, тиоловой протеиназой, функционирующей совместно с глутатион- инсулин-ирансгидрогеназой, расщепляющей дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями инсулина.

Фрагментация инсулина и его распад происходят преимущественно в печени, почках и плаценте.

Фрагменты инсулина обладают биологической активностью и участвуют в ряде метаболических процессов. Одной из осеовных функций инсулина является регуляйия транспорта глюкозы, аминокислот, ионов и др. метаболитов в клетки печени, почек, жировой ткани др. органов. Механизм действия этого гормона отличается от такового для др. пептидных гормонов и является уникальным в регуляции метаболических процессов. Инсулиновый рецептор представляет собой тетрамер, состоящий из двух α- и двух β-субъединиц, одна из которых обладает тироксиназной активностью. Инсулин при взаимодействии с α-субъединицами, расположенными на поверхности цитоплазматической мембраны, образует гормон- рецепторный комплекс. Конформационные изменения тетрамера приводят к активации трансмембранной β-субъединицы рецептора, обладающей тирозинкиназной активностью. Активная тирозинкиназа способна к фосфорилированию мембранных белков.Образуются мембранные каналы, через которые глюкоза и др. метаболиты проникают в клетки. Свободный инсулин под действием тканевой инсулиназы распадается на семь фракций, пять из которых обладают биологической активностью.

Кроме того, инсулин стимулирует ряд биосинтетических процессов: синтез нуклеотидов, нуклеиновых кислот, ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла, гликогена. В жировой ткани инсулин активирует процесс образования ацетил Ко А и жирных кислот. Он является одним из индукторов синтеза холестерина, глицерина и глицераткиназы.

Мутации в структуре инсулинового гена, нарушение механизмов посттранскрипционного и посттрансляционного процессинга приводят к образованию дефектных молекул инсулина и, как следствие, к нарушению обменных процессов, регулируемых данным гормоном. В результате развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет.

Разработка технологии производства искусственного инсулина является поистине триумфом генетиков. Сначала с помощью специальных методов определили строение молекулы этого гормона, состав и последовательнгсть аминокислот в ней. В 1963 г. молекулу инсулина синтезировали с помощью биохимических методов. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, включающий 170 химических реакций, оказалось сложно.

Поэтому в дальнейших исследованиях упор был сделан на разработку технологии биологического синтеза гормона в клетках микроорганизмов, для чего использовали весь арсенал методов генетической инженерии. Зная последовательность аминокислот в молекуле инсулина, ученые рассчитали, какой должна быть последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем этот белок, чтобы получить нужную последовательность аминокислот. «Собрали» молекулу ДНК из отдельных нуклеотидов в соответствии с определенной последовательностью, «добавили» к ней регуляторные элементы, нкеобходимые для экспрессии гена в прокариотическом организме Е.coli, и встроили эту конструкцию в генетический материал микроба. В результате бактерия смогла вырабатывать две цепи молекулы инсулина, которые в дальнейшем можно было соединить с помощью химической реакции и получить полную молекулу инсулина.

Наконец, ученым удалось осуществить в клетках Е.coli биосинтез молекулы проинсулина, а не только ее отдельных цепей. Молекула проинсулина после биосинтеза способна соответствующим образом преобразовываться (формируются дисульфидные связи между цепями А и В), превращаясь в молекулу инсулина. Эта технология имеет серьезные преимущества, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены до минимума. При разработке такой технологии была выделена информационная РНК проинсулина. Используя ее в качестве матрицы, с помощью фермента обратной транскриптазы синтезировали комплементарную ей молекулу ДНК, которая представляла собой практически точную копию натурального гена инсулина. После пришивания к гену необходимых регуляторных элементов и переноса конструкции в генетический материал Е.coli

Стало возможным производить инсулин на микробиологической фабрике в неограниченных количествах. Его испытания показали практически полную идентичность натуральному инсулину человека. Он намного дешевле препаратов животного инсулина, не вызывает осложнений.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.

Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

 

mykonspekts.ru


Смотрите также