Промышленное производство рекомбинантного инсулина. Рекомбинантный инсулин


Инсулин рекомбинантный - Справочник химика 21

    Рекомбинантные микроорганизмы широко используются для получения разнообразных белковых продуктов, применяющихся в медицине (например, инсулина), а также в качестве своего рода фабрик по производству имеющих коммерческую ценность метаболитов (например, антибиотиков). Белки синтезируются наиболее [c.359]     Крупные открытия в науке обычно делаются при разработке фундаментальных проблем. Мы разделяем мнение большинства врачей о том, что последние достижения биотехнологии, нашедшие применение в самых важных отраслях медицины, оказывают и будут оказывать революционизирующее воздействие на диагностику, лечение и понимание основ патологии многих тяжелых заболеваний. Ориентируясь на читателей, не имеющих медицинской подготовки, мы расскажем о том, какую важную роль играют в клинической практике некоторые новые подходы, а также широко используемые методы диагностики. Мы по необходимости ограничимся лишь немногими примерами, но читатель может без труда дополнить их множеством других использованием в терапии белков, которые можно синтезировать при помощи видоизмененных методами генетической инженерии микроорганизмов, применением моноклональных антител, ферментов и т. д. Мы не обсуждаем использующиеся при этом технологические процессы сколько-нибудь подробно (о них речь идет в других главах) исключение составляет лишь раздел о синтезе инсулина человека дело в том, что инсулин был первым белком, полученным с помощью технологии рекомбинантных ДНК и испытанным на людях, а также первым или одним из первых) препаратом такого рода, нашедшим применение в клинике. [c.325]

    В последние годы для крупномасштабного получения труднодоступных пептидов все более широкое распространение получают методы генной инженерии (технологии рекомбинантных ДНК). Некоторые из белков (инсулин, гормон роста), полученных этим методом, абсолютно идентичны природным белкам человека. Другое вещества, например гликопротеин эритропоэтин, идентичны нативным веществам по структуре полипептидной цепи, но немного отличаются от них по строению боковых углеводных цепей в зависимости от продуцирующей линии животных клеток. Получение белков и некоторых гликопротеинов в качестве стандартов генно-инженерным путем наиболее удобно в случае труднодоступных объектов (интерлейкины 1а и ренин, интерфероны человека). Проблемы контроля производства и детального исследования свойств рекомбинантных продуктов рассмотрены в работах [11, 12]. [c.35]

    Производство рекомбинантного инсулина, интерферона и т.д. [245] [c.169]

    Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

    Разнообразные гены были химически синтезированы, введены в клоны и использованы для направленного синтеза белков с помощью рекомбинантной ДНК. Например, инсулин — это белок, применяемый при лечении диабета. Ген, синтезирующий инсулин человека, получен химиками в 1978 г. Он был введен в плазмиду и внедрен в обычную бактерию Е. соИ. Еще один пример — гормон роста человека (соматотропин). Это белок, представляющий собой полипептид из 191 аминокислоты. Ген, кодирующий этот белок, был получен сращиванием одной из природных ДНК с химически синтезированной. В 1979 г. белок начал производиться в клетках Е. соИ. Он испытывается как возможное средство лечения карликовости и сходных заболеваний, вызываемых недостатком гормона роста. [c.119]

    В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

    Природные молекулы часто обладают биологической активностью и, следовательно, представляют интерес для медицины. Но из-за высокой стоимости или нежелательных побочных эффектов их обычно нельзя применять в фармацевтических препаратах. В таких случаях обычно используют химически сходные молекулы или фрагмент природного продукта. Технология рекомбинантных ДНК может помочь в производстве модифицированных форм. Полипептидные гормоны оказывают биологическое влияние самого различного рода, но при пероральном приеме они часто неэффективны или быстро теряют эффективность. Дальнейший прогресс в химическом модифицировании белков, возможно, поможет устранить эти недостатки. Часто белок, полученный по технологии рекомбинантных ДНК, требует модификации для реализации его биологической активности. Это касается, в частности, уже упоминавшегося инсулина. Химическая модификация инсулинового белка, производимого бактериями Е. соИ, позволила получить новый биологически активный гормон. [c.120]

    Особенно ярко новейшие успехи биотехнологии проявляются в практической медицине главным образом потому, что их распространение из лабораторий в промышленность, а затем и в клинику происходит в последние годы удивительно быстро. Так, первые публикации об экспрессии гена инсулина человека в Е. соИ появились в 1979 г. Полученный на основе рекомбинантных ДНК инсулин человека был испытан на добровольцах, не страдающих диабетом, в 1980 г., а уже в 1981 г. велись развернутые клинические испытания. [c.325]

    Е. Ген инсулина человека. Ген человеческого инсулина (рис. 51.9) локализован в коротком плече хромосомы 11. У большинства млекопитающих экспрессируется один ген инсулина, организованный подобно человеческому гену, но у крыс и мышей имеются два неаллельных гена. В каждом из них закодирован особый проинсулин, дающий начало двум различным активным молекулам инсулина. В настоящее время разработан метод получения человеческого инсулина в бактериальных экспрессирующих системах с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, проблему получения этого гормона в количествах, необходимых для больных диабетом, можно считать решенной. [c.252]

    Ген, кодирующ ий образование гормона роста человека, был синтезирован искусственно и встроен в генетический материал Е.соН аналогично тому, как это сделали с геном инсулина. В настоящее время проблема производства высококачественного, безопасного для здоровья пациентов соматотропина в необходимых количествах и при минимальных затратах полностью решена. Более того, с помощью технологии рекомбинантных ДНК получены штаммы микроорганизмов, способные синтезировать и другие факторы роста человеческого организма. Для целей сельского хозяйства большое значение имела организация производства гормона роста крупного рогатого скота (впервые — американской фирмой Монсанто). Его применение позволяет значительно (до 15% и более) повысить удойность коров. Сам ген, кодирующий образование соматотропина, пытаются использовать в генетической инженерии животных для выведения ускоренно растущих пород. Так, получены обнадеживающие результаты на рыбах. Лососи с встроенным геном гормона роста способны достигать потребительских размеров за один год вместо двух в отличие от обычных рыб. [c.34]

    Следует отметить также, что образование нерастворимых телец включения в бактериальных клетках в ряде случаев (например, при крупномасштабной наработке инсулина человека) является преимуществом, а не недостатком, поскольку тельца могут облегчать очистку рекомбинантных белков и защищать их от протеолитической деградации. [c.123]

    По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genente h впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки Es heri hia oli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представ- [c.15]

    С развитием технологии рекомбинантных ДНК природа биотехнологии изменилась окончательно и бесповоротно. Появилась возможность оптимизировать этап биотрансформации более прямым путем, создавать, а не просто отбирать высокопродуктивные штаммы, использовать микроорганизмы и эукариотические клетки как биологические фабрики для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусньгх антигенов и множества других белков. Технология рекомби-нантньгх ДНК позволяет получать в больших количествах ценные низкомолекулярные вещества и макромолекулы, которые в естественных условиях синтезируются в минимальных количествах. Растения и животные стали естественными биореакторами, продуцирующими новые или изме- [c.18]

    Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин. В настоящее время генно-ин-женерный инсулин широко применяется в медицинской практике. [c.502]

    Четвертый период в биотехнологии - генотехнический начался с 1972 года. В этот период, например, бьша, создана первая рекомбинантная молекула ДНК, был выделен лактозный ген из кишечной палочки, поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками. Для генотехнического периода характерны разработка интенсивных процессов (вместо экстенсивных), получение суперпродуцентов создание продуцентов разработка и внедрение экологически чистых технологий, автоматизация и компьютеризация биотехнологических процессов [5,22], [c.5]

    Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

    Были клонированы гены ряда белков, необходимых в медицине. Нужный для лечения диабета инсулин в настоящее время получают из поджелудочной железы забитых на бойне животных. Хотя такой инсулин удовлетворяет сегодняшние потребности в этом препарате, тем не менее в связи с увеличением случаев заболевания сахарным диабетом, которому в США подвержено более 5% населения, в какой-то момент спрос может превысить предложение. Кроме того, инсулин забиваемых на бойнях животных не идентичен по своей аминокислотной последовательности инсулину человека, и потому для некоторых людей он неэффективен и даже непереносим. Недавно удалось заставить Е. соН синтезировать инсулин человека, введя в нее соответствующий ген. Полученный таким способом синтетический инсулин человека уже применяется при лечении диабета. Сходным образом благодаря рекомбинантным ДНК стало возможным использование в лечебной практике гипофизарного гормона роста (соматотропина), ранее недоступного для медицинских целей. Это важно потому, что гормон роста животных из-за различий в аминокислотной последовательности соматотропина человека и животньк неэффективен при лечении карликовости человека. [c.989]

    Одно из практических применений технологии рекомбинантных ДНК—получение медикобиологической продукции. Генная инженерия дает возможность получать в больших количествах белки, которые не могут быть выделены применением обычных методов очистки (интерферон, плазмино-ген-активирующий фактор) кроме того, с помощью рекомбинантных ДНК можно нарабатывать специфические белки человека для замены используемых в клинической практике аналогичных белков животных (инсулин, гормон роста). Достоинства обеих технологий очевидны. [c.46]

    Новые комбинации генов можно создать и искусственным путем в лабораторных условиях с помощью таких ферментов, как рестриктирующие эндонуклеазы, ДНК-лигаза и терминальная трансфераза. Чтобы встроить чужеродный ген в геном клеток Е. соИ, этот ген сначала пришивают к вектору, которым служит либо плазмида Е. соИ, либо ДНК фага Х. Полученная рекомбинантная ДНК может затем попасть в клетку Е. oli, ковалентно включиться в ее хромосому и в составе этой хромосомы реплицироваться. Если новый ген, содержащийся в рекомбинантной ДНК, обладает подходящими сигнальными последовательностями, указывающими начало и конец транскрипции, то такой ген будет транскрибироваться и транслироваться с образованием соответствующего белкового продукта. Многие гены из животных клеток уже были введены в бактерии, а бактериальные гены в свою очередь были встроены в эукариотические клетки. С помощью бактерий, в геномы которых введены соответствующие гены, можно получать применяемые в медицине белковые препараты-инсулин, гормон роста и интерфероны. [c.991]

    Человеческий ген инсулина вьщелен из короткой ветви 11-й хромосомы. Синтез человеческого инсулина в бактериальной экспрессивной системе осуществляют с помощью рекомбинантной ДНК-технологии. Рекомбинантный, а также бычий и свиной инсу-лины используются в медицине для лечения больных инсулинзависимым сахарным диабетом (I типа). [c.389]

    Гормон роста — соматотропин — синтезируется в ацидофильных клетках гипофиза. Концентрация гормона в гипофизе — 5—15 мг/г, что в 1000 раз выше по сравнению с другими гипофизарными гормонами. Соматотропин — это полипептид, который состоит из 191 аминокислотного остатка (ММ 22 ООО Да). Синтез и вьщеление соматотропина регулируются нейропептидами гипоталамуса — сомато-либерином и соматостатином. Гормон видоспецифичен. Для терапевтических целей получен рекомбинантный соматотропин. Соматотропин необходим для постнатального роста и нормального обмена углеводов, липидов и минеральных солей. Он обладает прямым (через цАМФ-зависимые эффекты) и опосредованным действием. Соматотропин непосредственно влияет на транспорт аминокислот и липолиз. Связанные с ростом эффекты опосредуются ЮР-1 (инсулиноподобный фактор, полученный по информации одного из семейства инсулиноподобных генов). Он усиливает включение сульфата в хрящи (поэтому сначала назывался сульфатирующим фактором, затем соматомедином С) по строению сходен с проинсулином (70 аминокислотных остатков). Из плазмы крови человека выделен ЮР-2, состоящий из 67 аминокислотных остатков. Этот инсулино- [c.403]

    Инсулиновый рецептор подробно исследован с помощью биохимических методов и технологии рекомбинантных ДНК. Он представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц (а и р) в конфигурации а -Р , связанных между собой дисульфидными мостиками (рис. 51.15). Обе субъединицы содержат много гликозильных остатков. Удаление сиаловой кислоты и галактозы снижает как способность связывать инсулин, так и активность этого гормона. Каждая из гликопротеиновых субъединиц обладает особой структурой и определенной функцией. а-Субъединица (мол. масса 135000) целиком расположена вне клетки, и связывание инсулина, вероятно, осуществляется с помощью богатого цисти-ном домена. Р-Субъединица (мол. масса 95000)— трансмембранный белок, выполняющий вторую важную функцию рецептора (гл. 44), т. е. преобразова- [c.259]

    Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. соН, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном -галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. [c.117]

    Из многих сотен препаратов, полученных методом генетической инженерии, в практику внедрена только часть интерфероны, интерлейкины, фактор VIII, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадках почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и др. Это обстоятельство можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, длительное время к этим препаратам и рекомбинантным штаммам микроорганизмов относились настороженно, опасаясь, что может произойти неуправляемое распространение экологически опасных рекомбинантных микроорганизмов. Однако в наши дни эти опасения практически сняты. Во-вторых, использование рекомбинантных штаммов продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов. На разработку технологии получения препаратов методом генетической инженерии, доклинические и клинические испытания их обычно затрачивается значительно больше средств, чем на получение штамма. В-третьих, при получении препаратов методом генетической инженерии всегда возникает вопрос об идентичности активной субстанции, вырабатываемой рекомбинантным штаммом-продуцентом, природному веществу, т. е. требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство идентичности, а также иногда решение дополнительных задач по приданию продукту природного характера. [c.101]

    В чем же причина такого аномального поведения рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в эндоплазмати-ческом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5-5,5, в то время как pH цитоплазмы бактериальных клеток приближается к 7,8. В этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Са2+. [c.120]

    Исходно цель опытов с использованием рекомбинантных ДНК состояла в получении важных с медицинской и экономической точек зрения белков, например вакцин и межклеточных пептидных посредников (инсулина, гормона роста и оксигоцина). Идея заключалась в клонировании гена, кодирующего данный полипептид, встраивании его в плазмиду, которая реплицируется в Е. соИ таким образом, чтобы промотор Е. соИ регулировал транскрипцию, а затем в синтезе на рибосомах Е. соИ больших количеств нужного белка. Почему эта довольно прямолинейная схема оказалась сложнее, чем вначале предполагалось (разд. 7.8) Во-первых, в большинстве эукариотических генов имеются интроны, а в генах Е. соИ их нет у бактерий отсутствует механизм сплайсинга, и поэтому невозможно получить соответствующую данному эукариотическому гену мРНК. Во-вторых, из первичных продуктов трансляции многих эукариотических генов, в частности из предшественников полипептидных гормонов, может образоваться активный генный продукт лишь в результате специфического посттрансляционного процессинга, который в клетках Е. соИ не осуществляется. Наконец, успешному получению больших количеств многих эукариотических белков мешает их токсичность для бактериальных клеток, деградация бактериальными протеазами и нерастворимость в цитоплазме бактериальной клетки. [c.359]

    Возможность использования трансгенных мышей для решения разнообразных биологических проблем можно проиллюстрировать на примере опытов с инсулиновыми генами. Ген инсулина экспрессируется только в р-клетках поджелудочной железы и регулируется г/мс-действующими элементами, расположенными в его 5 -фланкирующей области (рис. 1У.9). Если эту 5 -фланкирующую область инсулинового гена крысы присоединить к кодирующей области онкогена 5У40 (большого Т-антигена) и полученные рекомбинантные молекулы ввести в ранние эмбрионы мыши, то геном потомков будет содержать рекомбинантную ДНК (рис. IV. 16). [c.364]

    Многие микроорганизмы — бактерии, дрожжи, вирусы — используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов — продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы Е. соИ, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др. [c.95]

chem21.info

Рекомбинантный инсулин - презентация онлайн

Министерство образования и науки Российской Федерации Санкт – Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики Факультет пищевых биотехнологий и инженерии ВЫПОЛНИЛА СТУДЕНТКА ГРУППЫ Т4130: КОПЫЛОВА ТАТЬЯНА ПРИНЯЛ ПРЕПОДАВАТЕЛЬ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ: СКВОРЦОВА Н.Н.Инсулин - пептидный гормон, выделяемый βклетками о. Лангенгарса. Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными –SS- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат. Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.Инсулин был открыт Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом, работавшими в лаборатории Дж. Маклеода в Торонто в 1921 г. Исследователи выделили инсулин из поджелудочной железы собаки и ввели его панкреатэктомированному животному с клиническими проявлениями СД, что привело к нормализации уровня сахара и купировало симптомы диабета. Нобелевская премия 1923 г. по медицине была присуждена Бантингу и Маклеоду.При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин. Он состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков: недостаток поголовья скота; сложности хранения и транспортировки сырья; трудности выделения и очистки гормона; возможность развития аллергических реакций.

11. Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерханса.

Схема биосинтеза инсулина в βклетках островков Лангерханса. ЭР - эндоплазматический ретикулум. 1 - образование сигнального пептида; 2 - синтез препроинсулина; 3 - отщепление сигнального пептида; 4 - транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 - превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 - секреция инсулина и Спептида.

12. Модификация свиного инсулина синтетико-ферментативным методом

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной Отрет-бутильной группы получают инсулин человека.

13. Генно – инженерный способ

2 пути: Раздельное получение обеих цепей (разные штаммы - продуценты) с последующим фолдингом (образование дисульфидных мостиков), разделение изоформ Получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормонаПроинсулин

15. Химический синтез

1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов). 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В). 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид. 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь. 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей. 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин. Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина: Из опухолевых клеток поджелудочный железы выделяется мРНК инсулина. С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК. Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы. Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина. Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином. Из проинсулина выделяется инсулин. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или генов цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия. Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку. В институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генноинженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

22. Получение рекомбинантного инсулина

Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%. После разрушения клеток дезинтеграцией тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, затем добавляют дитиотреитол. Ренатурацию гибридного белка инсулина проводят в одну стадию путем инкубации в 5-10-кратном объеме буфера до стадии очистки путем кислотного осаждения. Гибридный белок хроматографируют на КМсефарозе. Ферментативное расщепление осуществляют последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок - 1:(500-1000). Между стадиями расщепления гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б проводят хроматографию на СП-сефарозе. Инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и выделением в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет упростить получение высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и повысить его выход в промышленном масштабе.

23. Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами

Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-Sepharose, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. Недостатками данного способа являются: использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 ч) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.«+»: • Идентичен по составу человеческому инсулину → нет аллергических реакций. • Более экономичен по сравнению с животным инсулином (1 кг инсулина можно получить в 25 кубовом ферментере, используя кишечную палочку, или необходимо 35 тыс. голов с/х животных. «-»: • Тщательный контроль выделения и очистки, т.к. примесь микробных липо- и глико-протеинов, обладают пирогенными свойствами.

ppt-online.org

Промышленное производство рекомбинантного инсулина — КиберПедия

 

Инсулинявляется регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков. В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

− недостаток поголовья скота;

− сложности хранения и транспортировки сырья;

− трудности выделения и очистки гормона;

− возможность развития аллергических реакций.

Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами. Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей

1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С- пептида.

При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

В отличие от инсулина аминокислотная последовательность с-пептида сильно отличается у разных видов млекопитающих, что делает невозможным получение его из животного сырья. Существующие способы получения с-пептида, можно разделить на три категории:

1) Получение с-пептида химическим синтезом. Этим способом получено большинство препарата, представленного на рынке в настоящее время .

2) Получение с-пептида биосинтетическими методами в составе слитых белков. Для получения с-пептида этим способом создается химерный белок, в котором за лидерным фрагментом следуют несколько последовательностей с-пептида, разделенных аминокислотами, обеспечивающих гидролиз специфическими протеазами. На первом этапе происходит культивирование микроорганизмов в ферментерах, затем в них индуцируется синтез рекомбинантного полипептида; клетки разрушаются, и рекомбинантный белок очищается и обрабатывается специфическими протеазами, приводящими к получению с-пептида. На заключительном этапе происходит очистка с-пептида от примесей. Данный способ может обеспечить большие объемы производства, но требует создания штаммов-продуцентов, отработки условий культивирования микроорганизмов, способов очистки рекомбинантного белка, а также создания и валидации методов контроля качества.

3) Получение с-пептида биосинтетическими методами совместно с инсулином. Этот способ производства заключается во введении некоторых модификаций в технологию получения рекомбинантного инсулина с целью оптимизации получения с-пептида, образующегося на определенных этапах производства, в основе которого лежит получение проинсулина, не подвергающегося модификациям. Данный способ имеет ряд преимуществ. Для получения с-пептида этим способом не требуется создания новых штаммов-продуцентов, отработки технологии очистки и сворачивания белка, создания новых инструментальных методов контроля производственного процесса.

 

 

cyberpedia.su

Получение рекомбинантного инсулина

Поиск Лекций

• Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.

• Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков

• Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

• При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин.

• Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.

• С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

• До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота

Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

1)недостаток поголовья скота;

2)сложности хранения и транспортировки сырья;

3)трудности выделения и очистки гормона;

4)возможность развития аллергических реакций.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.

• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

• 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

poisk-ru.ru

Рекомбинантный инсулин - online presentation

Министерство образования и науки Российской Федерации Санкт – Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики Факультет пищевых биотехнологий и инженерии ВЫПОЛНИЛА СТУДЕНТКА ГРУППЫ Т4130: КОПЫЛОВА ТАТЬЯНА ПРИНЯЛ ПРЕПОДАВАТЕЛЬ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ: СКВОРЦОВА Н.Н.Инсулин - пептидный гормон, выделяемый βклетками о. Лангенгарса. Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными –SS- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат. Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.Инсулин был открыт Фредериком Бантингом и Чарльзом Бестом, работавшими в лаборатории Дж. Маклеода в Торонто в 1921 г. Исследователи выделили инсулин из поджелудочной железы собаки и ввели его панкреатэктомированному животному с клиническими проявлениями СД, что привело к нормализации уровня сахара и купировало симптомы диабета. Нобелевская премия 1923 г. по медицине была присуждена Бантингу и Маклеоду.При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин. Он состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков: недостаток поголовья скота; сложности хранения и транспортировки сырья; трудности выделения и очистки гормона; возможность развития аллергических реакций.

11. Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерханса.

Схема биосинтеза инсулина в βклетках островков Лангерханса. ЭР - эндоплазматический ретикулум. 1 - образование сигнального пептида; 2 - синтез препроинсулина; 3 - отщепление сигнального пептида; 4 - транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 - превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 - секреция инсулина и Спептида.

12. Модификация свиного инсулина синтетико-ферментативным методом

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной Отрет-бутильной группы получают инсулин человека.

13. Генно – инженерный способ

2 пути: Раздельное получение обеих цепей (разные штаммы - продуценты) с последующим фолдингом (образование дисульфидных мостиков), разделение изоформ Получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормонаПроинсулин

15. Химический синтез

1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов). 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В). 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид. 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь. 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей. 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин. Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина: Из опухолевых клеток поджелудочный железы выделяется мРНК инсулина. С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК. Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы. Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина. Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином. Из проинсулина выделяется инсулин. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или генов цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия. Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку. В институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генноинженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

22. Получение рекомбинантного инсулина

Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%. После разрушения клеток дезинтеграцией тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, затем добавляют дитиотреитол. Ренатурацию гибридного белка инсулина проводят в одну стадию путем инкубации в 5-10-кратном объеме буфера до стадии очистки путем кислотного осаждения. Гибридный белок хроматографируют на КМсефарозе. Ферментативное расщепление осуществляют последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок - 1:(500-1000). Между стадиями расщепления гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б проводят хроматографию на СП-сефарозе. Инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и выделением в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет упростить получение высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и повысить его выход в промышленном масштабе.

23. Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами

Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-Sepharose, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. Недостатками данного способа являются: использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 ч) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.«+»: • Идентичен по составу человеческому инсулину → нет аллергических реакций. • Более экономичен по сравнению с животным инсулином (1 кг инсулина можно получить в 25 кубовом ферментере, используя кишечную палочку, или необходимо 35 тыс. голов с/х животных. «-»: • Тщательный контроль выделения и очистки, т.к. примесь микробных липо- и глико-протеинов, обладают пирогенными свойствами.

en.ppt-online.org

Рекомбинантный человеческий инсулин инструкция к препарату

Нозологическая классификация (МКБ-10): E10 Инсулинозависимый сахарный диабет. E10-E14 Сахарный диабет. E11 Инсулинонезависимый сахарный диабет. Z100 КЛАСС XXII Хирургическая практика Фармакологическое действие

Применение: Кетоацидоз, диабетическая, молочнокислая и гиперосмолярная комы, инсулинзависимый сахарный диабет (I типа), в т.ч. при интеркуррентных состояниях (инфекции, травмы, оперативные вмешательства, обострение хронических заболеваний), диабетической нефропатии и/или нарушениях функции печени, беременности и родах, инсулиннезависимый сахарный диабет (II типа) при резистентности к пероральным противодиабетическим средствам, дистрофические поражения кожи (трофические язвы, карбункулы, фурункулез), выраженная астенизация больного при тяжело протекающей патологии (инфекции, ожоговая болезнь, травмы, обморожения), длительный инфекционный процесс (туберкулез, пиелонефрит).

Противопоказания: Гиперчувствительность, гипогликемия, заболевания печени и/или почек (возможна кумуляция), грудное вскармливание (существует высокий риск экскреции инсулина с грудным молоком).

Побочные действия: Гипогликемия, постгликемическая гипергликемия (феномен Сомоджи), отек, нарушения зрения, инсулинрезистентность (суточная потребность превышает 200 ЕД), аллергические реакции: кожные высыпания с зудом, иногда сопровождающиеся диспноэ и гипотонией, анафилактический шок; местные реакции: покраснение, отечность и болезненность кожи и подкожной клетчатки (проходят самостоятельно в течение нескольких дней — недель), постинъекционная липодистрофия (повышение жирообразования в месте инъекции — гипертрофическая форма, или атрофия жира — атрофическая форма), сопровождающаяся нарушением всасывания инсулина, возникновением болевых ощущений при изменении атмосферного давления.

Взаимодействие: Эффект усиливают пероральные противодиабетические средства, алкоголь, андрогены, анаболические стероиды, дизопирамид, гуанетидин, ингибиторы МАО, салицилаты (в больших дозах) и др. НПВС, бета-адреноблокаторы (маскируют симптомы гипогликемии — тахикардию, повышение АД и др.), снижают — АКТГ, глюкокортикоиды, амфетамины, баклофен, эстрогены, пероральные контрацептивы, гормоны щитовидной железы, тиазидные и др. диуретики, триамтерен, симпатомиметики, глюкагон, фенитоин. Концентрацию в крови увеличивают (ускоряют всасывание) никотинсодержащие препараты и табакокурение.

Передозировка: Симптомы: гипогликемия разной степени тяжести, вплоть до гипогликемической комы.Лечение: при легкой гипогликемии глюкоза дается перорально, при тяжелой — в/в струйно (до 50 мл 40% раствора) с одновременным введением глюкагона или адреналина.

Способ применения и дозы: П/к. Больному, у которого гипергликемия и глюкозурия не устраняются диетой в течение 2–3 суток, из расчета 0,5–1 ЕД/кг, а затем дозу корректируют в соответствии с гликемическим и глюкозурическим профилем; для беременных в первые 20 нед доза инсулина составляет 0,6 ЕД/кг. Кратность введения может быть различной (обычно при подборе дозы используют 3–5-кратное), при этом суммарную дозу делят на несколько частей (в зависимости от количества приемов пищи) пропорционально энергетической ценности: завтрак — 25 частей, второй завтрак — 15 частей, обед — 30 частей, полдник — 10 частей, ужин — 20 частей. Инъекции производят за 15 мин до еды. В дальнейшем возможно двукратное введение (наиболее удобное для больных).

Меры предосторожности: Развитию гипогликемии способствует передозировка, нарушение диеты, физические нагрузки, жировая инфильтрация печени, органические поражения почек. Для профилактики постинъекционной липодистрофии рекомендуется смена мест инъекции, лечение заключается во введении инсулина (6–10 ЕД), смешанного с 0,5–1,5 мл 0,25–0,5% раствора новокаина, в переходную зону липодистрофии, ближе к здоровой ткани, на глубину 1/2–3/4 толщины жирового слоя. При развитии резистентности следует перевести больного на монопиковые и монокомпонентные высокоочищенные инсулины, временно назначить глюкокортикоиды и антигистаминные препараты. Аллергизация требует госпитализации больного, идентификации компонента препарата, являющегося аллергеном, назначения адекватного лечения и замены инсулина.

Особые указания: Снижение числа ежесуточных инъекций достигается комбинированием инсулинов разной продолжительности действия.

www.piljulja.ru

Рекомбинантный человеческий инсулин инструкция по применению

Рекомбинантный человеческий инсулин Латинское название: Recombinant Human Insulin Фармакологические группы: Инсулины Нозологическая классификация (МКБ-10): E10 Инсулинозависимый сахарный диабет. E10-E14 Сахарный диабет. E11 Инсулинонезависимый сахарный диабет. Z100 КЛАСС XXII Хирургическая практика Фармакологическое действие

Действующее вещество (МНН) Инсулин человеческий (Insulin human) Применение Рекомбинантный человеческий инсулин: Кетоацидоз, диабетическая, молочнокислая и гиперосмолярная комы, инсулинзависимый сахарный диабет (I типа), в т.ч. при интеркуррентных состояниях (инфекции, травмы, оперативные вмешательства, обострение хронических заболеваний), диабетической нефропатии и/или нарушениях функции печени, беременности и родах, инсулиннезависимый сахарный диабет (II типа) при резистентности к пероральным противодиабетическим средствам, дистрофические поражения кожи (трофические язвы, карбункулы, фурункулез), выраженная астенизация больного при тяжело протекающей патологии (инфекции, ожоговая болезнь, травмы, обморожения), длительный инфекционный процесс (туберкулез, пиелонефрит).

Противопоказания Рекомбинантный человеческий инсулин: Гиперчувствительность, гипогликемия, заболевания печени и/или почек (возможна кумуляция), грудное вскармливание (существует высокий риск экскреции инсулина с грудным молоком).

Побочные действия: Гипогликемия, постгликемическая гипергликемия (феномен Сомоджи), отек, нарушения зрения, инсулинрезистентность (суточная потребность превышает 200 ЕД), аллергические реакции: кожные высыпания с зудом, иногда сопровождающиеся диспноэ и гипотонией, анафилактический шок; местные реакции: покраснение, отечность и болезненность кожи и подкожной клетчатки (проходят самостоятельно в течение нескольких дней — недель), постинъекционная липодистрофия (повышение жирообразования в месте инъекции — гипертрофическая форма, или атрофия жира — атрофическая форма), сопровождающаяся нарушением всасывания инсулина, возникновением болевых ощущений при изменении атмосферного давления.

Взаимодействие: Эффект усиливают пероральные противодиабетические средства, алкоголь, андрогены, анаболические стероиды, дизопирамид, гуанетидин, ингибиторы МАО, салицилаты (в больших дозах) и др. НПВС, бета-адреноблокаторы (маскируют симптомы гипогликемии — тахикардию, повышение АД и др.), снижают — АКТГ, глюкокортикоиды, амфетамины, баклофен, эстрогены, пероральные контрацептивы, гормоны щитовидной железы, тиазидные и др. диуретики, триамтерен, симпатомиметики, глюкагон, фенитоин. Концентрацию в крови увеличивают (ускоряют всасывание) никотинсодержащие препараты и табакокурение.

Передозировка: Симптомы: гипогликемия разной степени тяжести, вплоть до гипогликемической комы. Лечение: при легкой гипогликемии глюкоза дается перорально, при тяжелой — в/в струйно (до 50 мл 40% раствора) с одновременным введением глюкагона или адреналина.

Способ применения и дозы: П/к. Больному, у которого гипергликемия и глюкозурия не устраняются диетой в течение 2–3 суток, из расчета 0,5–1 ЕД/кг, а затем дозу корректируют в соответствии с гликемическим и глюкозурическим профилем; для беременных в первые 20 нед доза инсулина составляет 0,6 ЕД/кг. Кратность введения может быть различной (обычно при подборе дозы используют 3–5-кратное), при этом суммарную дозу делят на несколько частей (в зависимости от количества приемов пищи) пропорционально энергетической ценности: завтрак — 25 частей, второй завтрак — 15 частей, обед — 30 частей, полдник — 10 частей, ужин — 20 частей. Инъекции производят за 15 мин до еды. В дальнейшем возможно двукратное введение (наиболее удобное для больных).

Меры предосторожности: Развитию гипогликемии способствует передозировка, нарушение диеты, физические нагрузки, жировая инфильтрация печени, органические поражения почек. Для профилактики постинъекционной липодистрофии рекомендуется смена мест инъекции, лечение заключается во введении инсулина (6–10 ЕД), смешанного с 0,5–1,5 мл 0,25–0,5% раствора новокаина, в переходную зону липодистрофии, ближе к здоровой ткани, на глубину 1/2–3/4 толщины жирового слоя. При развитии резистентности следует перевести больного на монопиковые и монокомпонентные высокоочищенные инсулины, временно назначить глюкокортикоиды и антигистаминные препараты. Аллергизация требует госпитализации больного, идентификации компонента препарата, являющегося аллергеном, назначения адекватного лечения и замены инсулина.

Особые указания: Снижение числа ежесуточных инъекций достигается комбинированием инсулинов разной продолжительности действия.

www.superotvet.ru


Смотрите также